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The Progress and Application of Protein E lectrophoresis
Renqian Zhong, Honglian Geng
仲人前，耿红莲
第二军医大学长征医院实验诊断科、全军临床免疫中心
Laboratory Diagnostics, Changzheng Hospital, Second Military Medical University and Clinical Immunology Center of PLA, Shanghai, 200003
电泳鼻祖Tiselius教授定义电泳为荷电的胶体颗粒在电场中的移动。他发明了最早期的界面电泳，用于研究蛋白质分离，开创了现代电泳技术的新纪元，使与蛋白质有关的研究得以飞速发展。生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+ 浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号。迁移的方式目前可以分为三类：根据分子尺寸大小和形状、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特性。原则上按电泳的原理来分，现在有三种形式的电泳分离系统：即移动界面电泳（moving boundary electrophoresis）、区带电泳（zone electrophoresis）和稳态电泳（steady state electrophoresis）或称置换（排代）电泳（displacement electrophoresis）。
在自由移动界面电泳中，电场是加在大分子溶液和缓冲液之间的一个非常窄的界面上，带电分子的移动速率是通过观察界面的移动来测定的。该方法目前已基本被区带电泳所取代。区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粒、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在多用聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶。稳态电泳或称置换电泳的特点是分子颗粒的电泳迁移在一定的时间后达到一个稳态，等电聚焦和等速电泳均属于这一类。
电泳技术和方法的更新和改进，离不开先进电泳仪器的问世。电泳仪器种类很多，随着技术的不断发展，电泳仪器的分析对象也越来越专一化。按形式可分为垂直型和水平型；按分析对象可分为蛋白质分析用、核酸分析用和细胞分析用；按功能可分为制备型、分析型、转移型、浓缩型等。从垂直管型盘状电泳发展到垂直板状电泳，再发展到半自动和全自动水平平板电泳仪，其分辨率越来越高，操作越来越简单，电泳时间越来越短，功能越来越多。
随着各种先进的电泳仪和新技术新方法的不断出现，电泳技术被广泛应用于生物化学、药物化学、实验诊断学、分子生物学等各个领域。本文主要就近年来备受关注的双向电泳、毛细管电泳和免疫电泳等技术和方法的发展和应用做一评述。
一、 双向电泳——蛋白质组分析的开门技术
随着后基因组时代的到来，对许多生物体的研究已进入蛋白组学研究阶段。蛋白组研究的手段主要是高通量双向电泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)进行蛋白质的分离，再由专业计算机软件进行图像分析，然后通过质谱（mass spectrometry, MS）技术及蛋白质数据信息处理技术对凝胶上的蛋白质进行分离与鉴定。其中的一个关键步骤就是细胞或样品中蛋白质的分离，目前最佳的分离方法就是双向电泳。据估计人体组织细胞至少含15000种蛋白，每种蛋白质又有不同的加工修饰，使得蛋白质种类和数目众多。传统的单向电泳方法最多只能分析100种蛋白样品，而一块典型的2-DE胶大约能分离2000个蛋白点，最好的大约能分离10000多个蛋白点。
经典的双向电泳方法是1975年O'Farrell首先提出的，其基本原理就是根据蛋白质的等电点和分子量的差异而使之分别在等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中分离出来。他用双向电泳系统和放射自显影的方法得到了大肠杆菌蛋白提取液的1100种不同组分的5000个蛋白点的图谱。由于这个技术的极高的分辨率，它被称为“蛋白爆炸”（Protein explosion）。Anderson将其称为ISO-DALT技术(ISO即等电点，DALT即道尔顿)。双向电泳第一向为等电聚焦电泳，其基本原理是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。等电聚焦电泳发展迅速，较早出现的是载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient)等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；80年代初建立起来的固相pH梯度(immobilized pH gradients, IPG)等电聚焦，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率可达0.001pH; 发展到后来出现了载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等电聚焦”（hybrid isoelectric focusing）。第二向SDS-PAGE电泳是按蛋白质亚基分子量的大小进行分离，有垂直和水平两种形式，变化不大。随着第一向等电聚焦电泳的发展，双向电泳也从以载体两性电解质pH梯度介质等电聚焦为第一向的ISO-DALT系统，发展形成以固相pH梯度等电聚焦为第一向的IPG-DALT双向电泳体系。IPG-DALT具有分辨率高，重复性好，信息量大的优点。IPG胶梯度范围大，电内渗作用弱，对碱性蛋白如核糖体蛋白有很好的分离效果。IPG-DALT系统经过十几年的发展，已进行了较大改进，如分离极碱性蛋白的IPG胶其pH可达12; 可应用极窄pH胶条提高分辨率; 已有商业化的IPG胶条出售等。为了更好的使细胞内低组分蛋白在2-DE胶中得以成像，蛋白的染色技术就需要不断发展改进，在蛋白组研究中应用较为广泛的主要是银染、考马斯亮蓝染色和SYPRO RUBBY染色法。虽然近年来有多维色谱质谱联用（LC-MS/MS）技术应用于蛋白组研究的报道，但是2-DE作为蛋白组研究的开门技术，仍有着不可替代的地位。目前存在的主要问题是对2-DE的结果分析，一些专业软件如MelanieⅡ, ImageMaster 2D等已可以对2-DE的结果进行比对、分析。Oxford Glycosciences 已制作了一个生物信息平台Rosetta TM, 预示着生物信息学领域将会快速发展。而目前兴起的纳米技术，也将为蛋白质组超微量样品的分析带来新的机遇。
双向电泳技术经过20多年的发展和改进，目前已广范应用于基础研究，临床诊断与治疗及相关病理机制研究等各个领域。包括蛋白质转录与转录后修饰研究，细胞分化凋亡研究，疾病标志探测，疗效监测，新药开发，癌症研究，蛋白纯度检查，小量蛋白纯化等许多方面，是蛋白质研究的核心技术。但是目前的2-DE技术离人们所期望的2-DE还有一定差距: 对细胞内的低拷贝蛋白、极端酸性或碱性蛋白、分子量过大或过小蛋白、难溶蛋白等的电泳分离或检测还有困难；虽然对2-DE过程的自动化进行了初步尝试，但是还未实现整个2-DE阵列技术的完全自动化，使大规模的筛选计划受到限制。相信在不久的将来2-DE技术会朝着自动化、高流通量、高灵敏度的方向发展，日臻完善以满足人们的需要。
二、毛细管电泳——新型快速高效分离分析技术
毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)是近年发展起来的一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。1981年，Jorgenson 和Lukacs两位学者首先在75μm内径的石英毛细管内用高电压进行分离，并阐述了相关理论，创立了现代毛细管电泳技术。短短数年间, 毛细管电泳技术迅速发展，综合了高效液相色谱和凝胶电泳的共同优点，具有快速、高效、高灵敏度、易定量、重现性好及自动化、在线检测等优点，可以说是经典电泳技术与现代微柱分离技术完美结合的产物。已广泛应用于氨基酸、肽、蛋白质、离子分析、对映体分析和很多其他离子态物质的分析。毛细管电泳技术的基本原理是根据在电场作用下离子迁移的速度不同而对组分进行分离和分析，以极小内径（20μm~200μm）的毛细管为工具，在高压电场作用下，根据在缓冲液中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异，正离子、中性分子和带负电荷的分子依次流出，在靠负极的一端开一个视窗，可用各种检测器直接测定待测组分。目前已有多种高灵敏度的检测器为毛细管电泳仪的检测提供了质量保证，如紫外检测器（UV）、激光诱导荧光检测器（LIF）、能提供三维图谱的二极管阵列检测器（DAD）以及电化学检测器（ECD）。毛细管电泳技术发展至今，分离模式主要有以下几种:
①毛细管区带电泳（ capillary zone electrophoresis, CIE）是最基本也是最常用的一种操作模式，应用范围最广，可用于各种蛋白质、肽、氨基酸的分析;
②毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE）常用于RNA、DNA片段分离和测序、PCR产物分析;
③毛细管胶束电动色谱（ micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC）是唯一既能分离中性溶质又能分离带电组分的CE模式;
④毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing,CIDF）已经成功用于测定蛋白质等电点，分离异构体;
⑤毛细管等速电泳(capillary isotachophoresis, CITP);
⑥毛细管电色谱(capillary electrochromatography,CEC);
⑦亲和毛细管电泳，可以用于研究诸如抗原－抗体或配体－受体等特异性相互作用。
⑧CE/MS联用，CE的高效分离与MS的高鉴定能力结合，成为微量生物样品,尤其是多肽、蛋白质分离分析的强有力工具。
毛细管电泳在临床检验医学中应用十分广泛。根据用途不同可分为：临床疾病诊断、临床蛋白分析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、同工酶分析、PCR产物分析、DNA片断及序列分析等。从所检测样品来源，可分为：尿样、血浆或血清、脑脊液、红细胞、其它体液或组织、以及实验动物活体试验。从所分离分析的组分看，包括肽类、各种蛋白质、病毒、酶、糖类、寡核苷酸、DNA、小的生物活性分子、离子和药物及其代谢产物等。CE在临床应用方面，还有一些新的报道，比如尝试将高灵敏度的分子信标技术与CE相结合，利用CE激光诱导检测器检测被分子信标标记的PCR产物；国外已开始探索利用毛细管电泳对PCR产物作DNA单链构象多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP)分析筛查点突变。毛细管电泳的应用尚属起步，随着CE技术的不断发展和完善，将在临床应用和基础研究领域发挥更重要的作用。
三．免疫电泳——免疫技术与电泳技术的完美结合
免疫分析的最大应用领域是人血蛋白的研究。许多疾病都是由于血中一种或多种蛋白浓度或结构的改变所致。新鲜正常血清经血清蛋白区带电泳可分出5-7条区带，即前白蛋白、白蛋白和5条球蛋白区（α1、α2、β1、β2和γ球蛋白）。α1区带主要由α1抗胰蛋白酶形成，α2由血清类粘蛋白和α2巨球蛋白所组成，β1主要为转铁蛋白，β2主要由C3组成。患者血清蛋白电泳某区域升高或降低提示不同的临床意义，如急性炎症时，可见α1、α2区百分比升高，慢性肝病或肝硬变呈现白蛋白显著降低，在α2～γ区，出现狭窄而浓集的蛋白克隆增生区带，即M蛋白区带，对多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、重链病的诊断和疗效观察有意义。一些体液如：脑脊液、唾液、腹水、肠液等蛋白含量较少，普通血清蛋白区带电泳不易区分，可用免疫方法测定。在基础研究工作中，由于抗原-抗体反应的高度专一性，蛋白-蛋白、蛋白-配体相互作用的研究都能使用免疫电泳技术。免疫电泳技术是基于抗原的电泳迁移以及与抗体的专一性免疫沉淀反应，是让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运行方向，从而加快沉淀反应的速度。免疫电泳技术种类很多，如：对流免疫电泳（CIEP）— 实际上是加速的免疫扩散；琼脂免疫电泳 — 在双扩散基础上发展起来的琼脂电泳与琼脂免疫扩散相结合的免疫电泳技术; 火箭免疫电泳（RIE） — 在单向免疫扩散基础上发展起来的一种能定量的免疫电泳技术；交叉免疫电泳（CIE）— 琼脂免疫电泳和火箭电泳的发展。在上述几种免疫电泳技术中，琼脂免疫电泳在和免疫学相关的基础研究和临床实验中应用最广，并不断派生出新的技术和方法。
免疫固定电泳包括琼脂糖凝胶电泳和免疫沉淀两个过程，检测标本可以是血清、尿、脑脊液或其它体液。其原理为待测标本按常规进行电泳,使不同蛋白质进行组分，然后用单克隆抗血清作用于被组分的蛋白，进行抗原抗体反应，使抗原在电泳位置上被固定。目前临床实验室用血清免疫固定电泳（IF）技术进行M蛋白的分型与鉴定，敏感性可达50-150mg/dl，且操作简便省时，分辨率高。另有报道利用琼脂糖凝胶电泳的免疫固定法，直接检测非浓缩晨尿的本-周氏蛋白，可协助临床诊断浆细胞病和B淋巴细胞增生性疾病。脂蛋白a [LP(a)]是心、脑血管疾病的一个独立危险因子，可利用固相内抗原、抗体反应来进行分离。血清经琼脂糖凝胶电泳，待测血清中的LP(a)与介质中含有的抗LP(a)抗体结合成复合物，同时介质中含有的阳离子能抑制其它脂蛋白的泳动速度，从而使LP(a)与其它脂蛋白分离开来。脑脊液“寡克隆区带”(OCB) 的定性检测可协助临床诊断多发性硬化症。CSF中的蛋白质采用高分辨率的琼脂糖凝胶电泳分离，并经抗原和辣根过氧化物酶标记的特异性IgG抗体进行反应来鉴定OCB，经此酶免疫标记放大技术和显色步骤，蛋白质检测灵敏度可达31-125μg/L。 自从Alper于1969年首先利用免疫固定电泳技术(IFE)进行蛋白多态性的研究以来，IEF不断发展成熟并已广泛应用于临床疾病的诊断、鉴别诊断和基础研究等领域。
电泳技术种类繁多，上述电泳技术只是近年来发展较快、应用较广的几种。另有报道用十二烷基磺酸钠-琼脂糖凝胶电泳（SDS-AGE）进行非浓缩尿蛋白分型，尿蛋白类型的不同可协助临床判断肾脏损伤的部位。以往国内大部分实验室采用SDS-PAGE盘状电泳进行尿蛋白分离，SDS-PAGE具有较高的分辨率，但操作繁琐、需预浓缩尿液，耗时长、需4-5天才能报告结果，不符合临床要求。SDS-AGE利用琼脂糖凝胶的选择性成分及多孔性，亦根据蛋白质的分子量，将蛋白尿分为肾小球性、肾小管性、混合性、生理性及溢出性蛋白尿。该技术操作简便、尿液无需浓缩，省时、仅需三小时即可完成，其电泳图谱及扫描图形可作为资料永存，便于比较分析。SDS-AGE能在无损伤情况下对尿蛋白组分进行分析，可早期诊断肾损伤的部位，值得推广应用。电泳技术除了应用于血液、尿液、脑脊液及其它体液的蛋白质分析外，近期发展起来的单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis, SCGE）技术是一种在单细胞水平上检测真核细胞DNA损伤与修复的方法。其基本原理是将单个细胞包埋于琼脂糖凝胶中进行裂解、电泳、荧光染色和显微镜检测，细胞DNA损伤产生的链缺口在电泳中迁移形成典型的“慧星”图像,根据迁移长度和荧光强度可定量分析DNA损伤。SCGE具有敏感、简便、迅速、样本需量少、不需放射性标记等优点，在放射生物学、遗传毒理学、肿瘤发病机制、肿瘤治疗学、群体生物学监测以及细胞凋亡等领域应用前景广泛。
电泳技术经过几十年的发展和更新，已成为临床检验、实验诊断和分子生物学等学科必不可少的研究手段，尤其是在血液、尿液、脑脊液或其它体液的蛋白质分离分析中，有着举足轻重的地位。现代电泳技术能不断朝着快速、高效、自动化的方向发展，依赖于相关技术和仪器的改进。以集成毛细管电泳芯片的出现和应用为代表，毛细管电泳正逐渐实现仪器的小型化和集成化。随着双向电泳数据库的建立以及专业化分析软件的问世，2-DE技术得到了更广泛的应用。当然电泳技术也面临着新的挑战：就双向电泳技术来说，尚无高智能化的分析软件和真正的高通量鉴定工具; 虽然理论上双向电泳、微量测序、银染、质谱技术可达到ng水平，但实际操作中常存在差距; 另外由于先进的电泳仪器价格昂贵，目前国内很多实验室仍采用较为落后的仪器和方法，这在很大程度上制约了科学研究的发展。相信随着人们对电泳认识的深入和新技术新方法的不断涌现，以及低成本、高性能电泳仪器的出现，电泳技术将会有更为广阔的应用前景。 | 
