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苏春康 苏振文 邓华宝 福建省永定县医院检验科 364100
吴泉明 叶晨 福建省临床检验中心 350007
前言
在2005.06.14-06.17厦门召开的第三届全国临床检验实验室管理学术会议上，专家们越来越认识到“量值溯源”的前景和重要性。陈文祥研究员、Dr.Robert Rej、彭明婷主任、张伟明教授等都在大会上对“溯源”作了深刻的学术报道。笔者将近几年在一系列的检验学术会议上专家的讲座重新整理，将较完善的理论和广大检验同行共同学习。
一、量值溯源的一些概念和溯源链的结构及工作原理
检验结果的准确性，是临床医生对疾病进行诊断和治疗的重要依据。在临床实验室中如何确保检验结果的准确，是每个检验人员必须关心的问题。通常，在检验过程中使用可溯源性校准品是保证检验结果准确性的前提，而参加室间质评价活动，可以发现实验室结果准确性的偏倚。检验方法学分类包括：决定性方法（definitive method ）：经详尽研究尚未发现不准确度或不确定性原因的方法；参考方法（reference method ）：经详尽研究证实其不准确度与不精密度可以忽略的方法；常规方法（routine method ）：可满足临床或其他目的需要的日常使用的方法。
标准物质又称参考物质（reference material），是一类充分均匀，并具有一个（或多个）确定的特性值的材料或物质，用以校准仪器设备、评价测量方法，或给其它物质赋值。标准物质的定值结果一般表示为：标准值±不确定度。“标准物质证书”是介绍标准物质的技术文件，是研制单位向用户提出的质量保证书和使用说明。附有证书的标准物质称为有证标准物质（certified reference material, CRM），其特性值由建立了溯源性的程序确定，使可溯源至准确复现的表示该特性值的计量单位，且每个标准值都附有给定置信水平的不确定度。 一级标准物质（primary reference material）：稳定、均一，采用高度准确、可靠的若干方法定值，可用于校准决定性方法及为二级标准物质定值。在我国，一级标准物质是测量准确度达到国内最高水平的有证标准物质，由国家技术监督局批准、颁布并授权生产。如：人血清无机成分分析标准物质（GBW09135）和血清胆固醇标准物质（GBW 09138）。
二级标准物质（secondary reference material）：用一级标准物质校准，参考方法定值。如：红细胞微粒标准物质—GBW（E）090001、胆红素标准物质—GBW（E）090002 、氰化高铁血红蛋白溶液标准物质—GBW（E）090004 和纯化血红蛋白标准物质—GBW（E） 090011。
校准物（calibrator）：用二级标准物质校准，常规方法定值。用于对常规方法和仪器的校准。
质控物（control material）：具有与检测过程相适应的特性，其成份与检测样本的基质相同或相似。应使用充分均一和稳定的质控物，其瓶间变异必须小于监测系统预期的变异，其常规检测应有助于确认报告范围。为了保证质控方法对系统性能提供独立的评价，必须将 质控物与校准物区分开来。
分析系统与可溯源性：分析系统是指检验方法所涉及的仪器、试剂、参数和校准品，其检验结果经一系列合理实验的验证能够满足厂家声明的要求，其量值能够溯源到高级标准物质。在实际工作中，实验室使用分析系统进行检验，其检验结果具有可溯源性。改变分析系统中的任一因素，其检验结果的可溯源性将被打断。如果必须改变分析系统中的某种因素，实验室在应用该方法前，则应对改变后的系统作出适当的性能评价，以确定方法准确性的偏倚和检验结果的可溯源性[1]。
ISO对溯源性的定义如下：测量结果或标准量值的属性，它使测量结果或标准量值通过连续的比较链与给定的参考标准联系起来，给定的参考标准通常是国家或国际标准，比较链中的每一步比较都有给定的不确定度。
临床检验的量值溯源可以有不同模式，但其中心内容是使各测量方法的测量值与一公认的标准发生联系。图1为ISO 17511[2]描述的溯源图。一个样品或参考物质的测量结果的溯源性通过一系列对比测量而建立，对比测量中的测量过程和校准物质的计量学等级由低到高组成一条连续的链(溯源链)。链的顶端是国际单位制(SI)单位(基本或导出单位)，SI单位国际通用，不随时间和空间的变化而变化，因此它们是溯源链的最高等级。一级参考测量过程是具有最高计量学特性的参考测量过程，它须是基于特异、无需同量校准而能溯源至SI单位、低不确定度的测量原理，目前认为可用于一级参考测量过程的测量原理仅限于同位素稀释/质谱(ID/MS)、库仑法、重量法、滴定法和依数性(如凝固点降低)测量等。一级参考物质是测量单位的体现体，具有最可能小的测量不确定度，它可由一级参考测量过程直接定值，也可通过可靠的杂质分析间接定值，一级参考物质一般是高度纯化的被测物质。二级参考测量过程是经充分论证，其不确定度能满足特定要求，能用于低一级测量过程评价和参考物质鉴定的测量过程，二级参考测量过程用一级参考物质校准。二级参考物质用一种或多种二级参考测量过程定值，一般具有与实际样品相同或相似的基质，主要用于量值传播。一级和二级参考测量过程的建立和维持及一级和二级参考物质的制备有高度的知识、技术和设备要求，故一般由国际或国家计量机构及经认证的参考实验室完成。一级和二级参考物质一般是经计量权威机构或行政机构认证的有证参考物质(CRM)[3]。上述一级和二级参考测量过程和参考物质称参考系统，有时参考系统也包括从事参考测量的实验室。图1中其它环节的工作原理与上述原理类似，只是计量学等级较低，也较灵活，可依各厂家或实验室的不同情况而异。溯源链自上而下各环节的溯源性逐渐降低，而不确定度则逐渐增加，因此量值溯源过程应尽量减少中间环节。从计量学角度上讲，理想的情况是用一级参考测量过程直接测量样品，省去所有中间环节，这在临床检验中显然是不可能的。
美国标准与技术研究所（NIST）对上述溯源原理的描述见下图2。用词和溯源链结构与ISO 17511有些差异，但基本原理是一致的。值得指出的是，图2中的决定性方法和参考方法应相当于ISO 17511中的二级参考测量过程。如前述，ISO 17511中的一级参考测量过程是具有最高计量学特性的测量过程，但它在不少情况下仅限于鉴定一级参考物质(高度纯化的被测物)，不适合分析生物样品，而二级参考测量过程则是高度特异的、适合于复杂基质样品分析的测量过程。二级参考测量过程可利用多种可靠的分析原理，其中利用ID/MS原理的测量过程多称为一级测量方法或决定性方法。各种二级标准测量过程是临床检验量值溯源和其它质量保证工作中的主要角色。
在临床检验中量值溯源主要包括仪器、检测方法和标准物质三个方面的溯源。其中，标准物质的溯源是目前国际和国内社会最为关注的一个方面。标准物质是实现准确一致的测量、保证量值有效传递的计量标准。在实际测量中，使用不同等级的标准物质，按照由高到低，逐渐进行量值的追溯，直到国际单位，这一过程叫做量值的“溯源过程”。相反，从国际基本单位用不同等级的标准物质由高到低进行量值传递，最终到实际测量现场的过程，被称为量值的“传递过程”。由此，形成了化学测量的完整的溯源—量传体系。量值传递是量值溯源的基础。在整个溯源链中，标准物质起着重要作用。
二、临床检验参考系统现状
参考系统是量值溯源的基础。临床检验样品是生物样品，有高  度复杂性。图1和图2是理想的溯源链，即溯源终点是SI单位。溯源至SI单位的前提是必须有一级参考测量过程、一级参考物质和二级参考测量过程。目前国际上临床检验项目大约有400-600个，能溯源至SI单位的只有25-30个，它们主要是一些化学定义明确的小分子化合物，包括电解质类物质(如钾、钠、氯、镁、钙、锂离子等)、代谢物类物质(如胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、肌肝、尿酸、尿素等)和某些甾体类激素及甲状腺激素[6]。这些项目虽占的数目不大，却是临床检验常规项目的主要组成部分。
除上述少量项目外，其余多数临床检验项目因被测物质(主要是生物大分子类物质)的复杂性(如混合物、异构体等)，其一级参考测量过程的建立和一级参考物质的制备非常困难，其量值溯源只能停止在较低水平。这类检验项目目前国际上有以下几种情况，一种是有国际参考测量过程(非一级参考测量过程)，也有用此参考测量过程定值的国际参考物质，如糖化血红蛋白；另一种是有国际参考测量过程，无国际参考物质，大约有30个检验项目属于这种情况；第三种情况是有国际参考物质及定值方案，但无国际参考测量过程，属于这种情况的检验项目约有250个；还有约300个即无国际参考测量过程，也无国际参考物
我国临床检验量值溯源基础结构建设处于初始阶段。目前唯一具有比较完整参考系统的检验项目是胆固醇，该参考系统由卫生部北京老年医学研究所和国家标准物质研究中心制备的纯度标准物质（GBW 09203a 和GBW 09203b）（一级参考物质）、卫生部北京老年医学研究所建立的参考方法和该研究所制备的血清标准物质（GBW 09138）（二级参考物质）组成。我国还有20余项与临床检验有关的国家一级标准物质，其中包括国家标准物质研究中心制备的尿素（GBW 09201）和尿酸（GBW 09202）纯度标准物质（ISO 17511定义中的一级标准物质），其余则主要是生物样品中无机成分标准物质。目前国内有关学者正在研究甘油三酯、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇、酶催化浓度、血液学指标等的标准化问题。
三、以酶测定为例，如何建立参考系统
酶浓度的SI单位为“每立方米溶液中每秒中能转化的克分子底物量”。符号为molsm或者（mol/s）/m）。也可以用 kat/m。它处在图的上端或者是最后溯源终点。但在目前，还普遍使用酶活性单位U（曾称为国际单位，即每分钟能转化一个微克分子底物的酶量）。1U=1umol.min=16.667×10 kat。原级参考方法要确定被测对象，特别是酶的成份，说明测量体系，特别是反应条件。其结果是酶活性浓度的SI单位。是操作的第一水平，也是校准的第二层次。测量的每一步骤都应明确并且可估计其不确定度。并最好根据文件GUM：1993得出合成不确定度。每一测定步骤要清楚地说明并由实验控制，都不使用自动化的测定方法。
原级参考方法最好由国际组织如IFCC通过协商一致的过程制定。如果没有国际性文件，也可由国家计量研究所或者标准委员会制定暂订的参考测定方法。通过原级参考方法指定原级校准品（原级参考品）的数值及相应的不确定度。并最好是通过正规的多实验室验证实验，并包括检查其可转换性。原级校准品也最好由国际性组织制备。由欧共同体参考物质和测量研究所（IRMM）制备的BCR有证参考品是一个很好的例子。由原级参考方法校准次级参考测定方法的测量体系，反应条件必须保证其测量对象一致。同样要说明数值的计算与不确定度。为便于操作，常使用一些机械化的器具。往往参考实验室或厂家制订或实施次级参考方法。
通过次级参考方法确定次级参考品的数值。一般由单个参考实验室或厂家实验室进行。厂家选择的检测方法由一个或多个原级或次级参考方法校准，或者就是次级参考方法。厂家工作校准品的定值和测量的不确定度由次级参考方法或直接由原级参考方法来定值和估计其不确定度。所使用的参考品应证明在参考测定方法与被校准方法之间有适当的可转换性。厂家的常备测量方法应该由厂家的一个或多个工作校准品或计量学上高一级的校准品进行校准。厂家的常备测量方法应接近常规测方法，但测定不确定度应较小。厂家的产品校准品的定值可由厂家的常备测定方法或任何计量学上更高一级的方法来指定,但所用校准品在指定的测量方法和常规测量方法之间可以进行转换。最终用户的常规测量方法应该用厂家的校准品来校准。厂家有责任说明用其提供的试剂和测量方法测定常规标本的量与原级参考方法所测得量相同。
在如何使酶活性测定结果达到一致，人们经历了一个认识的过程。早在上世纪七十年代末期，IFCC的酶学委员会就企图通过建立酶的原级参考方法来达到酶活性测定量值的一致。实践的结果证明单依靠参考方法很难达到这一点，这首先是随科学的进展，方法不可能固定不变，其次在国际范围内对原级参考方法常不易得到一致的同意，例如IFCC就曾公布过使用不同缓冲液的两种测碱性磷酸酶（ALP）原级参考方法。但是最大的困难是以前公布的参考方法都基於30℃，而临床实验室广泛应用的是37℃。所以到二十世纪末IFCC一方面将参考方法改为37℃，另一方面企图通过制备通用性或者转换性很高的参考品来统一酶活性测定的结果。例如日本的Ashasi公司就生产这类酶的校准品，可有效地将原理相似，具体测定方法有所差异的不同方法的测定结果统一起来。但随之产生一个如何对此类参考品定值的问题，建立一个参考实验室网络用原级参考方法对参考品或参考物质定值，显然是一种较理想的解决途径。
所以说，一个完整的酶活性测定参考系统应该由下列三个方面组成：建立有权威的原级参考或决定方法；制备符合要求有可转换性的参考品或物质；建立参考实验室网络，用原级参考方法对原级参考品定值。下面分别对此三个方面作一说明：
1.建立有权威的原级参考方法
在酶活性测定系统中所使用的不同层次的方法（原级和次级 参考方法、实验室常规方法、厂家选用方法）应具有相似的分析特性。特别是酶活性测定方法，测定系统的微小变化都有可能引起测定结果的持久性改变。
对于测定方法的分析特性，首先是选用的方法有数据和资料 说明这些方法都是测定相同的量值。例如a-淀粉酶有不同的同工酶，要保证参考系统中所用的测量方法对所测不同同工酶种类之间结果相一致或相接近。
其次要保证在溯源体系中溯源垂直链中所用方法具有相同的分析特性。为说明此问题，常使用最终使用者的标本，例如IFCC常使用一系列来自人类的标本，而不使用源泉自动物的标本或质控品来判断不同方法结果的一致性。
IFCC酶学委员会在建立酶活性测定的参考方法方面作了大量工作，从七十年代开始，陆续建立了下列酶在30℃下的参考测定方法：AST，ALT、LD、CK、GGT、ALP、AMY等。随自动生化仪的普遍使用，大多数临床实验室倾向固定使用37℃进行生化测定。从九十年代后期开始，IFCC在以前公布的30℃酶测定方法基础上设计并建立37℃的酶活性测定参考方法。在这些方法中对底物浓度、pH、缓冲液种类和浓度、辅酶和辅因子以及测定的延滞期、测定酶活性的时间间隔等进行了优化。制定了详细，精确和固定的标准操作程序；在分析的每一步骤中计算出溯源的数据（不确定度）。
迄今为止,IFCC酶学委员会已发布了ALT、AST、CK、GGT、LD五个酶在37℃的测定参考方法，正准备公布AMY的参考方法，正在制定ALP、CHE和LPS的参考方法。
2.制备和原级参考品
原级参考品（物质）最重要的特性是基质效应（matrix effect）没有或者很少可忽略不计。或者说是否有可交换性（communitability）。物质的可交换性是指对某一指定物持用两种测量方法所测定结果之间数学之间的一致性。应该用参考方法或常规测定方法对一系列相关的人类（常规）标本进行比较和评估。只有当用厂家规定的工作校准液校准仪器后，使用常规方法测定人类标本结果x，与参考方法测定结果y之间，不存在统计学上的显著差异，才能证明此校准液是有用的。没有经过此类评估的所谓校准液或者标准液的值在临床化学测定中并不能保证准确的结果，不具有溯源的价值。所使用的人类标本，最好是未添加任何外加物质。必须添加时应尽量模拟自然的人类标本。
目前欧共体的参考物质和测量研究所（IRMM）已能提供多种合格的酶活性参考品，有四种参考品能提供37℃的酶活性值。IRMM参考物质是分装在玻璃安瓿瓶中冻干品，复溶在1nl酶稳定液中，稳定液或是人或牛血清白蛋白基质，并充入氮气。 | 
