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董一弘 康熙雄
北京天坛医院实验诊断中心 100050
ABSTRACT
The High Performance Capillary Electrophoresis （HPCE）was rapidly developed in the late 1980’s.It is the production of classic electrophoresis technology combining with modern micro-columniation. HPCE has many merits, such as high sensitivity, high differentiation, high speed, little sample, and low cost. HPCE is mostly used for detection of human serum proteins in clinic. Nowadays, HPCE is widely applied in the field of nucleic acid assay, for example DNA sequencing, gene mutation analysis, nucleic acid quantification analysis, etc. HPCE also plays an important role in Pharmaceutical analysis.
Key word：HPCE;Clinic application;expectation
高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是80年代后期迅速发展起来的一项新技术。高效毛细管电泳(HPCE)是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物, 他具有高灵敏度,常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol;高分辨率,其每米理论塔板数为几十万,高者可达几百万乃至千万,而HPLC 一般为几千到几万;高速度,最快可在几十秒内完成,有报道在90秒内分离6种血清蛋白;样品少，只需毫微升(10-9L) 的进样量;成本低,只需少量(几毫升) 流动相和价格低廉的毛细管;应用范围广,由于HPCE 符合了以生物工程为代表的生命物理学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶、抗体) ,核酸乃至脱氧核糖核酸(DNA) 的分离分析要求得到了迅速的发展。由于以上优点以及分离生物大分子的能力, 使HPCE 成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。当然,HPCE还是一种正在发展中的技术, 有些理论研究和实际应用正在进行与开发。
一、高效毛细管电泳技术(HPCE)的发展史
1967年Hjerten最先提出在高电场作用下，以在3mm直径的毛细管内进行自由溶液的区带电泳（Capillary Zone Electro-phoresis, CZE），1974年报道了以200～500μm内径玻璃毛细管内进行的区带电泳分析。1981年Jorgenson和Lakecs首先在75μm内径的石英毛细管内用高电压进行分离,并阐述了有关理论,创立了现代毛细管电泳技术。1984年Terabe等建立了毛细管胶囊变动色谱。1987年Hjerton 建立了毛细管等电聚焦。Cohen和Kargor 提出了毛细管凝胶电泳。1988年RoseT和Jorgenson应用毛细管电泳,微量制备了50pmol的蛋白质和肽。1988年、1989年出现了第一批商品毛细管电泳仪器。1990年改进和应用了紫外检测器。1992年激发诱导荧光检测器诞生。至今毛细管电泳技术得到不断改进和更新，敏感度和分辨率均达到预期的高效分离效率。
二、高效毛细管电泳技术的基本原理[1]和基本装置[2]
高效毛细管电泳(HPCE)统指以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间迁移速度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。仪器结构包括一个高压电源、一根毛细管、一个检测器和两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中,带电粒子在电场的作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。CE所用的石英毛细管,在pH>3的情况下其硅胶表面带负电,和溶液接触时形成了一双电层,在高电压作用下,双电层中的水合阳离子引起溶液在毛细管内整体向负极方向流动,形成电渗流( EDF)。粒子在毛细管电解质溶液中的迁移速度,等于电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子电泳方向和电渗一致,故最先流出。中性粒子电泳速度为零,故其迁移速度相当于电渗流速度。负离子运动方向和电渗流方向相反,但因为电渗流速度大于电泳速度,故它将在中性粒子之后流出。这样因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
HPCE的基本装置由毛细管、电解液槽、进样器、高压电源和检测器组成(图1)。
三、高效毛细管电泳技术的分离模式
毛细管电泳按分离模式分为毛细管区带电泳、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦和胶束电动毛细管色谱和毛细管电色谱等类型[3]。其中以毛细管区带电泳应用最为广泛，胶束电动毛细管色谱近年来发展也较快．其它分离模式应用还较少。
1.毛细管区带电泳(Capilary Zone Electrophoresis，CZE)
毛细管区带电泳是以具有PH缓冲能力的电解质溶液为载体，以毛细管为分离室的一种高压区带电泳，是应用最早也最为广泛的一种分离模式[4]。其分离原理是根据被分析物的电泳淌度不同实现分离。在外加电场作用下，具有不同电泳淌度的分离对象将在彼此分开的区带中迁移，而具有相同电泳淌度分离对象将在同一个区带中共迁移。
毛细管区带电泳除具有一般的电泳迁移外．还受到电渗的影响。电渗流指的是体相溶液在外加电场作用下整体向一个方向运动的现象，它是伴随着电泳而产生的一种电动现象，在毛细管电泳分离中起着重要作用。在毛细管区带电泳中(毛细管内壁如果没有进行修饰)．正离子迁移的方向与电渗方向一致．负离子迁移的方向与电渗方向相反。因此，正离子在毛细管的迁移速度加快．负离子在毛细管的迁移速度减慢。多数情况下．电渗的速度比电泳速度快5～7倍[5]。故在毛细管中负离子也总是向负极移动。所以在毛细管区带电泳中利用电渗流可将正、负离子和中性分子一起朝一个方向(如阴极方向)产生差速迁移．在一次毛细管区带电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析。需要说明的是．分析阳离子时．由于电渗流方向与离子移动的方向一致．不必处理毛细管内壁．但分析阴离子时．电渗流方向通常与离子移动的方向相反．故必须用烷基铵盐(如十二烷基三甲基溴化铵)类物质处理毛细管内壁．以使电渗流反向[6]。
2.胶束电动毛细管色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MECC)
胶束电动毛细管色谱是在电泳缓冲液中加入离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠 SDS),当溶液中表面活性剂浓度超过临界胶束浓度时．表面活性剂分子之间的疏水基团聚集在一起形成胶束假固定相，通过分离对象在胶束相和水相之间的分配系数不同而实现分离。虽然SDS胶束带负电，但一般情况下，电渗速度仍大于胶束的电泳速度，故胶束仍以较低的速度向负极移动。
胶束电动毛细管色谱的突出优点是不仅能分析离子化合物，还能分析不带电荷的中性化合物，把电泳分离的对象从离子化合物扩展到中性化合物．从而拓宽了毛细管电泳的应用范围。此外，胶束电动毛细管色谱还能很快且很容易地通过改变流动相和胶束相的组成来增加分离选择性．非常适合于手性化合物的分离。
3.毛细管凝胶电泳(Capilary Gel Electmphoresis，CGE)
凝胶电泳是凝胶移到毛细管中作为支撑物进行分离的区带电泳。凝胶是一种固态的分散体系，具有多孔性，类似分子筛的作用。被分离物在通过装入毛细管内的凝胶时，按照各自分子的体积大小逐一分离，分子体积大的首先被分离出来，适用于生物大分子的分析，可纯粹按分子体积大小进行分离(SDS-PAGE)，以决定蛋白质的分子量，可以识别一个碱基差异的寡核苷酸，可分离DNA片段，如微卫星(STR)分析，可改变凝胶的浓度来控制分离的范围，如PCR产物的分析。
4．等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing，IEF)
两性电解质在分离介质中的迁移，在毛细管内形成pH梯度，各种具有不同等电点的多肽和蛋白质按照这一梯度迁移到其不同的等电点位置并停下，由此产生一条非常窄的聚焦区带，利用等电点的细微差异进行分离，将不同的蛋白质聚焦在不同的位置上后，阴极的缓冲液换成盐类，再加上高压，使末端引起梯度降低，让组分一个个通过检测器可求得精确的等电点。
5．等速聚焦电泳(Isotachophoresis，ITP)
在被分离组分与电解质一起向前移动的同时进行聚焦分离的电 泳方法。与IEF一样，ITP在毛细管中的电渗流为零，缓冲系统由前后两种不同淌度的电解质组成。分离时毛细管内首先导入具有比被分离各组分高电泳淌度的前导电解质，进样后再导入尾随电解质(淌度低于被分离组分)。在强电场的作用下，各被分离组分在两种电解质之间的空隙中发生聚焦分离。选择处理或未处理硅胶毛细管均可。电渗流可用0.25％羟脯氨酰甲基纤维素抑制。前导电解质：5nM磷酸，尾随电解质：缬氨酸。在分离开始时，电流会由于高淌度的电解质完全充满毛细管而迅速增大，进入分离过程时，电流会随着低淌度的电解质进入毛细管而下降。
6．细管电色谱(capillary electrochromatography，CEC)
CEC是将高效液相色谱众多的固定相填冲到毛细管中，以样品与固定相间的相互作用为分离机制，以电流流相为驱动力的色谱过程。
四、高效毛细管电泳技术的临床应用
1.蛋白质的分析
毛细管电泳在蛋白质分析方面的应用非常广泛，包括蛋白质的分离、纯度分析，蛋白质组学研究等等。
采用HPCE分离血清蛋白, 结果重复性好，可信度高 。前白蛋白在血清中的浓度可表明营养状态，且是确定恶性肿瘤、炎症、肝硬化、何杰金氏病的重要指标，多数电泳法难以分辨，而用HPCE法很易分离定量，检测波长为214或200nm．CE增加了白蛋白部分的分辨率，这导致对双白蛋白血症检测的灵敏度有了很大的提高。CE法对肾病综合征，慢性炎症，自身免疫病和肝硬化等多克隆免疫球蛋白的分析显示出明确的特征，对典型的单克隆轻链和低浓度单克隆蛋白的检测有较高的敏感性。用等电聚焦毛细管电泳(CIEF)和区带电泳(CZE)可分离出十几种Hb变异链，对地中海贫血的临床诊断具有重要意义。CE能分离几种糖蛋白的糖基构型，可鉴别糖化血红蛋白A1、Alc和其他异构体，对糖尿病的监控具有指导价值。CE可将血浆脂蛋白分离出14个亚组份，如在分离缓冲液中加入表面活性剂，可在短时间内对两个主要组份：高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)进行定量。对LDL进一步分离为三个亚组份：LDL，中密度脂蛋白(IDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)，并对各组份的比例进行推算，从而对脂蛋白异常者提供不同脂肪代谢的信息。CE还被用于进行尿蛋白分析及其它体液蛋白质的分析，如脑脊液、唾液、胸膜漏出液和胸膜渗出物。此外，CE还被用于对单个人癌细胞中的蛋白质进行分析。
目前蛋白质组学研究的毛细管电泳方法进展很快， 因为传统的蛋白质分离方法已不能满足蛋白质组学研究的需要。蛋白质组即一定时期的细胞、组织和生物体中得以表达的一整套蛋白质，蛋白质的分离和测定是解决蛋白质组学研究的关键。Locke等报道了用毛细管区带电泳技术进行样品的浓缩、分离及检测，蛋白质的检测浓度范围从每微升皮克级到近飞克级，样品体积几微升到几百微升[7]，为蛋白质组学研究奠定了良好的基础。
2.核酸的分析
CE除了被用于DNA序列分析[8]和DNA片段长度分析[9]外，近年来，CE作为一种高通量的手段在突变筛查方面得到了普遍的应用。Venter[10]等人及Peltonen、Mckusick[11]等用CE技术对与疾病相关的分子构象进行了研究，认为该技术对疾病的诊断、预防和治疗提供了新的可能。以CE为技术基础的人类基因组计划[12]的实施导致了基于CE技术的高通量突变筛查技术的发现[13，14]，加之除CE技术之外的其它一些主流突变检测技术如变性高效液相色谱技术[15]和高密度寡核苷酸杂交芯片技术[16]的发展，使人们对单核苷酸多态性相关研究的巨大需求得以满足[17]。
3.药物的分析
CE在药物分析中也有着十分广泛的应用，可用于化学药物和生化药物分析，抗生素药物分析，中草药分析及生物制品鉴定等。中毒与药物滥用监督方面已有相关综述报道[18] ,目前主要检测的滥用药物已有阿片生物碱、大麻酚类衍生物、苯丙胺、甲基苯丙胺及相应的代谢物20多种。滥用药物种类多,结构相似,用CZE法不易分离,文献报道多用MECC法,样品则有血清、尿、唾液等。CE的优点在滥用药物的检测方面极为突出,如张亚海等[19]采用缓冲液为ψ(0.05mol/L磷酸二氢钠－磷酸氢二钠∶乙腈)=80：20、pH=6.9、温度20℃、紫外波长214nm、15kV的分离电压,成功检测出海洛英依赖者的尿吗啡含量。
据估计,常用的200多种药物中,一半以上至少具有1个手性中心,而这些药物中的75%～90%是以外消旋体形式在市场销售,所以为了准确了解药效和安全用药,有必要对手性药物的各个异构体进行分离并分别考察各自的生理活性;另外需要注意的是一些非手性药物,如抗精神病药物氟哌啶醇和抗癫痫药物苯妥因,因为它们的体内代谢物都是手性的,因此也存在立体选择性代谢问题。对手性药物的各个异构体进行分离,能更好地了解药效和安全用药,制定合理的给药方案,为剂量调整提供科学依据。目前，大部分手性药物分离研究的首选方法仍为HPLC，有学者对HPLC及HPCE两种方法用于手性药物的分离进行了对比研究，结果表明HPCE在手性药物的分离分析方面具有更高的效率。
4.其他小分子／离子的检测
CE能分离血和尿样品中血管造影剂含量、草酸盐等弱阴离子，检测尿样中十几种卟啉物质和维生素C异构体。在新生儿的遗传性有机酸尿症筛查中可检测1O种有机酸标志物，如丙二酸二甲脂、戊二酸、3-甲基戊二酸、N-乙酰天冬氨酸、2-氨基乙酸、丙酸、乳酸、异戊酸、尿黑酸、2-氧代异戊酸等。
五、展望
高效毛细管电泳是在散热效率极高的毛细管内(10～200mm)进行的，操作简单，分析速度快，样品需要量少，灵敏度高，成本相对低，如果要反复使用毛细管和可自行配制缓冲液，因而比传统电泳具有更大的优势。近年来，毛细管电泳技术在研究生物大分子间的相互作用方面也得到了很大的发展。目前CE在临床上应用最多的是蛋白质分析与鉴定，该技术已十分成熟，国外在90年代已作为常规试验，国内也正在掀起[20]。高效毛细管电泳是当今分析化学和生物医药学公认的前沿，该技术必将被临床医学实验室所接受，不仅能用于常规项目的分析，还可用于其他特殊项目的检验。随着人类基因组计划的实施，人类基因组计划的完成比预期时间一再提前，其主要工具是毛细管电泳仪。但是人类基因组图谱并没有告诉我们所有基因的“身份”以及它们所编码的蛋白质。人体内真正发挥作用的是蛋白质，其中可能隐藏着开发疾病诊断方法和新药的“钥匙”。随着“后基因时代”，一个以“蛋白质组”为重点的生命科学新时代的到来，需要对蛋白质有更多的研究，毛细管电泳技术将发挥更大的作用。高效毛细管电泳技术在临床应用尚属起步阶段，随着新型检测器、新型分离材料、仪器微型化等方面的研究以及HPCE技术与其它方法和技术如HPLC、MS等的联合应用的进一步深入，可以预言，CE技术将不断发展和完善，在临床应用领域中的前景会更加广阔。
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