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电泳技术在临床检验中的应用
沈佐君　白洁　丛玉隆
　　自从1946年瑞典物理化学家Tiselius教授研制的第一台商品化移界电泳系统问世以来,在近半个多世纪的时间里,电泳技术发展极其迅速。基于电泳原理的各种仪器设备不断问世,特别是20世纪80年代后,许多自动化电泳仪器相继为临床实验室所采用,电泳技术已成为基础医学和临床医学研究的重要工具之一。
目前,该技术已广泛用于蛋白质、多肽、氨基酸、核苷酸、有机物、无机离子等的分离和鉴定,甚至病毒与细胞的研究。特别是电泳所用支持介质由流动相改为固相支持物后,各种各样的电泳分析装置不断推出以适应不同教学、临床和科研工作的需要。当今,电泳技术与质谱技术联用在后基因组学研究中,正发挥者着巨大的作用,为临床检验的发展带来新的生机与活力。
一、电泳分析仪
电泳分析仪可分为两大类:临床实验室常规类,如全自动荧光/可见光双系统电泳仪、全自动醋纤膜电泳
仪、全自动琼脂糖电泳仪和全自动琼脂糖电泳仪;科研为主兼做临床样本类,如双向电泳及双向电泳2液相色谱2质谱联用、高效毛细管电泳及高效毛细管电泳2质谱联用、高效毛细管芯片电泳、DNA测序系统。
1. 全自动荧光/可见光双系统电泳仪:具有荧光/可见光双系统,在使用荧光试剂项目如肌酸激酶(CK) 、
乳酸脱氢酶(LD)同工酶时为全自动。只需将样品、试剂、琼脂糖凝胶电泳胶片放好后,操作人员可离机完成试验并得到结果,此为全自动电泳仪。但是使用可见光项目如蛋白电泳,中途人员需返回,将电泳胶片由电泳槽放入染色系统中才可完成试验。而最大优点是荧光系统全自动且灵敏度高,准确度高并且采用高压、低温系统,只需要20 min即可完成电泳分析,速度非常快。
2. 全自动醋纤膜电泳仪:为可见光单系统,使用醋纤膜电泳片。自动化程度高,只需将样品、试剂、电泳
片放好,人员可离机完成试验得到结果。但是因为使用醋纤膜致使灵敏度低,无法分析尿蛋白/脑脊液蛋白,对同工酶分析效果也不理想,多半实验室只用于血清蛋白电泳分析。
3. 全自动琼脂糖电泳仪:为可见光单系统,使用琼脂糖凝胶电泳胶片。优点为灵敏度高,可使用于低浓
度蛋白检验,如尿蛋白及脑脊液蛋白。而同工酶的分离效果也相当不错。但缺点为自动化程度较差,当电泳结束和染色脱色完成后,工作人员必须将电泳片由机器中取出,对实验室较为麻烦。但是因为这类仪器所能做项目比较多,且灵敏度较高仍为许多实验室所接受。
4. 全自动电泳分析系统:集上述仪器的优点,自动点样、电泳、呈色(或染色、脱色) 、烘干。可用各种电泳片,包括琼脂片、醋酸片、聚丙烯酰胺等,采用可见光及荧光呈色双系统,是一种较理想的电泳仪。
5. 双向电泳及双向电泳2液相色谱2质谱联用:双向电泳第一向为等电聚焦,第二向为梯度十二烷基磺酸
钠( SDS)电泳。样品经过电荷与质量两次分离后可得到分子的等电点、分子量等信息,这是目前所有电泳技术中分辨率最高,信息量最多的技术,已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具。自1975年,O′Farrel等建立这种技术后,已有许多改进,使得这一技术日趋完善。ISO2DALT系统的第一向是用管状凝胶,虽然分辨率高、上样量大、耐高盐等优点,但有阴极漂移而丢失碱性蛋白、载体两性电解质pH梯度不稳定、受电场和时间影响而重复性不好等缺点。20世纪80年代后期, Gorg等将固相pH梯度等电聚焦技术用作双向电泳的第一向,称为IPG2DALT。固相pH梯度等电聚焦没有阴极漂移, pH梯度稳定,分辨率高,重复性好,是目前流行的双向电泳技术。与传统的单向电泳方法最多只能分析100种蛋白质样品相比,双向电泳最多可分析5 000 ～ 10 000个蛋白点的图谱。双向电泳在分离蛋白混合样品,比较差异方面有不可替代的作用。当发现新的蛋白点时,将其切下再用液相色谱分离,与质谱联用,最后可鉴定新发现的蛋白质组分。
6. 高效毛细管电泳及高效毛细管电泳2质谱联用:高效毛细管电泳是以弹性石英毛细管为分离通道,以
高压直流电场为推动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。
利用毛细管代替平板凝胶,分离效率得以提高。高效毛细管电泳的应用范围从小分子、无机离子到生物大分子,甚至整个细胞,从带电粒子到中性分子都可用高效毛细管电泳方法进行分析。目前,毛细管与质谱的接口难题已经解决,人们能利用毛细管电泳的高效分离能力与质谱的鉴定技术联用发挥其特殊功能,发现未知的化合物。尤其是阵列毛细管电泳仪已经问世,这将克服目前大多数商品化毛细管电泳仪只能进行单根毛细管电泳的缺陷,这种高通量的新方法将会给后基因组时代的基因分析带来革命性的变化。
7. 毛细管电泳芯片:利用毛细管电泳芯片可以进行DNA长度、序列和基因分型等分析,在临床检测,尤
其在遗传病的诊断中具有重要意义。现在分离DNA,是利用芯片分离荧光标记的寡核苷酸,整个分离过程在45 s之内,而芯片的长度仅为318 cm。因为其可承载高电压(2 300 V / cm)并具有较小的样品体积,故有利于得到较好的分离效果。而用传统的毛细管电泳分离技术分离DNA样品,通常需要10～30 min,电压也只能加到500 V / cm。另外有人制作的用于高速DNA分离的芯片,有效长度仅为315 cm,分离从70～1 000bp的DNA片断,时间在120 s以内。目前,高速、高通量的毛细管电泳芯片已经发展得比较完善。2002年笔者曾在瑞典召开的第十五届国际微量分离与分析会议上见到Caliper公司设计的DNA电泳芯片,即在一个光盘大小的芯片上有96个毛细管电泳阵列,分别与96个样品池相连,呈辐射状,并采用一个旋转的共聚焦荧光检测系统对信号进行检测。此系统可以同时对96个不同的样品进行分离,分离检测过程在8 min以内。
8. DNA测序系统:该系统利用凝胶毛细管的原理,将多道毛细管阵列设计,用4种不同的荧光染色标记
4种核苷酸,在模板上合成DNA单链,然后在DNA外切酶的作用下进行碱基的连续水解和释放,用激光识
别和记录释放的碱基。可用于DNA序列测定,杂合子自动检测,点突变分析,等位基因鉴定, SNP筛查,杂合性缺失检测,AFLP指纹图谱,微卫星DNA的不稳定性分析,基因表达,测序质量评估,序列比较等。20世纪90年代中期,测序仪重大改进,集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳。2001年完成人类基因组框架图提前完成得益于多通道、集束化的毛细管凝胶电泳技术的出现。目前,在我国已有少数医院开始采用8 通道的DNA测序,系统开展用拉米夫定治疗乙型肝炎病毒(HBV)的YMDD突变检测。
二、电泳技术临床应用
随着新的电泳技术的出现,各种自动化电泳分析仪问世并相继被引入临床实验室,电泳技术在临床疾病
的诊断中正发挥越来越多的作用,特别是为各种体液蛋白质、同工酶等的检测提供了新的手段。
1. 血清蛋白电泳:新鲜血清经醋酸纤维薄膜或琼脂糖电泳、染色后,常见白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5条带。血清蛋白质电冰图谱是了解患者血清蛋白质全貌的有价值的方法,可用为初筛试验。急性炎症或急性时相反应时常以α1、α2 区带加深为特征;妊娠型α1 区带增高,伴有β区带增高;肾病综合征、慢性肾小球肾炎时呈现白蛋白下降,α1、β球蛋白升高;缺铁性贫血时可由于转铁蛋白的升高而呈现β区带增高,而慢性肝病或肝硬化呈现白蛋白显著降低,γ球蛋白升高2～3倍,示免疫球蛋白( Ig)多克隆高,甚至可见β～γ桥,还可在γ区呈现细而密的寡克隆区带;单克隆Ig异常症(M蛋白血症)则在电冰区带α～γ区呈现致密而深染,高度集中的蛋白克隆增生区带(M蛋白区带) 。
2. 尿蛋白电泳:尿蛋白电泳的主要目的是在无损伤的情况下,协助临床判断肾脏病变的严重程度。当不
能进行肾活检时,尿蛋白电泳结果能很好地协助临床判断肾脏的主要损害。尿蛋白电泳后呈现出中、高分子蛋白区带主要反映肾小球病变,呈现出低分子蛋白区带可见于肾小管病变或溢出性蛋白尿(如本周蛋白) ;混合性蛋白尿可见到各种分子量区带,示肾小球和肾小管均受累及。对临床症状不典型的患者及微量蛋白尿患者的诊断及各种肾脏疾病治疗过程中病情的动态分析也具有很大价值。
3. 脑脊液蛋白电泳:若在脑脊液(CSF)标本中检出寡克隆区带,而其相应血标本中未能检出区带,反映
是由中枢神经系统本身合成的Ig,具有重要临床意义。但为保证正确的比较与分析,须将患者血清和CSF
在同一天同步进行分析,以论证不同来源的Ig。中枢合成Ig是中枢神经系统疾患的一个重要信号,主要用
于多发性硬化症、痴呆、脊髓炎、亚急性脑白质炎、神经性梅毒等中枢神经系统疾患的诊断和鉴别诊断。
4. 血红蛋白及糖化血红蛋白电泳:应用电泳法鉴别患者血液中Hb的类型及含量对于贫血类型的临床
诊断及治疗具有重大意义。HbA2 增高是β2轻型地中海贫血的一个重要特征, HbA2 减低见于缺铁性贫血及其他Hb合成障碍性疾病(常见如α2地中海贫血) 。电泳发现异常Hb如HbC、HbD、HbE、HbK和HbS等则可诊断为相应的Hb分子病。在酸性条件下电泳,可将糖化血红蛋白的不同组分HbA1 a, HbA1 b和HbA1 c分离开来, HbA1 c形成与RBC内葡萄糖有关,可特异性反映测定前6 ～ 8周体内葡萄糖水平。此外,糖化血红蛋白可对某些患者因HbF增高所造成HbA1 c假性升高作出解释。
5. 免疫固定电泳:可对各类Ig及其轻链进行分型,最常用于临床常规M蛋白的分型与鉴定。一般用于
单克隆Ig增殖病、单克隆Ig病、本周蛋白和游离轻链病、多组分单克隆Ig病、重链病、CSF寡克隆蛋白鉴别、多克隆Ig病的诊断和鉴别诊断。
6. 同工酶电泳:临床上用于同工酶或同工酶亚型分析。(1)乳酸脱氢酶(LD /LDH)同工酶:用琼脂糖凝
胶电泳(AGE)法可分离出5种同工酶区带(LD1 ～LD5 ) 。主要用于急性心肌梗死(LD1 >LD2 )及骨骼肌疾病(LD5 升高)的诊断和鉴别诊断。恶性肿瘤、肝硬化时可见LD5 明显升高,或在胸腹水中出现一条异常LD6区带。(2)肌酸激酶(CK)同工酶:采用AGE法可分离出3种CK同工酶。当出现异常同工酶如巨肌酸激酶1 (CK1 ) 、巨CK2 等时,从电泳图谱上很容易发现。CK2MB在心肌梗死早期增加和短时间内达峰值也是心肌再灌注的指征。CK2BB增高见于脑胶质细胞瘤、小细胞肺癌和胃肠道恶性肿瘤,后者还常有CK2Mt增高。
(3) CK同工酶亚型:指CK2MM亚型(CK2MM1、CK2MM2、CK2MM3 )和CK2MB亚型(CK2MB1、CK2MB2 ) ,常采用琼脂糖凝胶IEF或高压电泳。采用琼脂糖凝胶高压电泳可进行CK同工酶亚型的常规快速分析,用于临床早期心肌损伤的临床诊断与鉴别诊断。主要用于急性心肌梗死的早期诊断,也可用于确定心肌再灌注、溶栓治疗后的病情观察。(4)碱性磷酸酶(ALP)同工酶:可采用AGE法进行ALP同工酶的常规快速分析。肝外阻塞性黄疸、转移性肝癌、肝脓疡和胆石症时胆汁ALP检出率很高,并伴有肝ALP增加,而肝内胆汁淤积、急性肝炎、原发性肝癌等主要表现为肝ALP增多,大多数不出现胆汁ALP。甲亢、恶性骨损伤、佝偻病、骨折、肢端肥大症所致骨损伤等,均引起骨ALP同工酶增加。骨ALP、高分子ALP同工酶对恶性肿瘤骨转移或肝转移的阳性预示值较总ALP高。胃肠道肿瘤、肺癌等恶性肿瘤时出现类肠型ALP。(5)γ2谷氨酰转肽酶(γ2GT/GGT)同工酶:用CAE或AGE法可将γ2GT同工酶分离为γ2GT1 ～γ2GT4 ,正常人只见γ2GT2 和γ2GT3 ,重症肝胆疾病和肝癌时常有γ2GT1 出现,γ2GT4 与胆红素增高密切相关。
7. 脂蛋白电泳:脂蛋白电泳检测各种脂蛋白(包括胆固醇和TG)主要用于高脂血症的分型、冠心病危险
性估计,以及动脉粥样硬化性及相关疾病的发生、发展、诊断和治疗(包括治疗性生活方式改变、饮食及调脂药物治疗)效果观察的研究等。
三、现状与展望
我国在电泳技术临床应用上与国外相比,存在明显差距。对于电泳项目,国内一般以血清蛋白为主,而
国外所做项目包括血清蛋白、尿蛋白、CK、LD、ALP、GGT同工酶、各种脂蛋白的胆固醇/甘油三酯等。对于电泳试剂,欧美这几年均以琼脂糖凝胶电泳片占95%以上,国内仍有40%市场采用醋纤膜电泳片。分析这些差距,有主观因素,也有客观原因。目前国内有不少临床实验室仍采用较落后的电泳设备或手工电泳方法,既不能及时、准确获得分析结果,也使得许多新的检验项目不能开展并应用于临床常规分析,影响了临床相关疾病的诊治和检验医学的发展。也有一些较大规模的医院,虽然购置了先进的自动化电泳系统,但由于宣传介绍不够,临床医生对电泳检测项目了解少而不开检验申请单。从目前临床实验室的要求来看电泳仪必须具有下列功能: (1)全自动:必须达到人员离机作业,由点样到出报告没有人工动作。(2)速度快:所有项目应在60 min内完成同时具备急诊项目如CK、LD等同工酶及亚型项目。(3)项目全:除了血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、CK、LD同工酶等传统项目外必须还能完成尿蛋白、脑脊液蛋白、免疫固定(单克隆抗体) 、ALP和GGT同工酶、胆固醇(高密度/极低密度/低密度脂蛋白) 、脂蛋白( a)等最新检验项目。(4)敏感度高:必须采用敏感度高的电泳片。如琼脂糖凝胶系统,才能得到准确度高,分辨率高的电泳结果。