免疫学检验室间质量评价的标准操作程序（EQA）

免疫学检验室间质量评价的标准操作程序（EQA）

实验室名称	项目	编号	制定日期
******	ELISA方法	******	**年**月**日

【目的】

采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。。

【该SOP变动程序】

本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【基本概念】

【质量控制】

是监视ELISA操作全过程，排除误差，维持标准化操作的一个管理过程。这一过程是通过一个反馈环路进行的：

1.确定控制的对象；

2.规定控制对象的标准（预期值）；

3.制定或选择控制方法和手段；

4.测量实际数据；

5.比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明原因。超出预定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。

6.采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。

质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期的"控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来的，其目的是检测检验过程中变异的可追查性原因。可追逆性的误差原因，是指除去随机误差以外的其他原因。在GLP概念里QC即指IQC，其定义为：由实验室工作人员采取一定的方法和步骤，连续评价本室工作的可靠性，旨在监测和控制本室常规工作的精密度，提高批内批间样本检验的一致性，以确定检验报告是否可靠或可否发出的一项工作。免疫测定方法的灵敏度和特异性要比生化方法高得多，因此QC手段不能照搬生化模式。

【灰区概念】

把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将COV值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。灰区概念对血站系统的献血员筛查尤为重要。灰区的设置有二种：

1.COV×（1±CV）， CV为该试剂的批内CV (一般在15-20%间)；

2.COV±2s，s为实验室做室内质控ROC的s。

【高值钩镰效应（HD-HOOK）】

在二位点夹心ELISA中，其剂量反应曲线的高剂量（HIGH DOSE，HD）区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀（HOOK），MILES（1974）根据此现象写实性地称之为"HD-HOOK"效应。产生该现象的分子机理有"分子变构说"和"浓度效应"等推论。一步法和二步法均存在"HD-HOOK"效应，只是前者出现的更早些，大多数是高值低吸光度，很少阴性结果。

【质量控制血清】

质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。

卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20℃保持半年定值不变。冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作用。

质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。

质控血清的制备，每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备本室使用的质控血清（以乙肝质控血清为例）。

1. 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。

2. 56℃加热10小时灭活。

3. 离心或过滤除去沉淀。

4. 用10%的小牛血清或正常人血清（PBS缓冲液）将收集的血清稀释至所需的浓度。如能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。

5. 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要求，则应加所要求浓度的质控物。

6. 标定含量。20-30次测定结果删除>±2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对比测定。

【室间质评的方法】

1.发质控物进行调查，这是目前国内外常见的形式，采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将结果报至组织者（部、省临检中心）。组织者通过统计分析，再将评价结果寄回实验室，使其了解工作质量，发现问题，提高质量。其缺点为由于各实验室吃小灶或互相打电话修改结果而达不到真正评价作用。

这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。

这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。

2.现场调查，事先不通知，临时派出人员到各实验室，规定采用常规方法，检测一组标本，进行评价。这种方法可以解决实际问题，进行现场指导，组织者常因人力、物力的原因而不能经常性进行。

派观察员到实验室进行试剂调查，这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组标本，进行评价。

【成绩计算方法】

1.定性试验：检验结果与预期结果一致，得100分，错误不得分，总计实验室的得分。从全部参评单位的得分中求出该批质控物平均分（X）和标准差（s），再通过公式计算出每一个实验室的得分比值（SI）

SI=（实验室得分-平均分X）/平均标准差（s），SI在0.0-0.9间为良好,1.0-1.9间为优秀,SI为负值时数值越大成绩越差。

2.定量试验：SI=（实验室测定值-预期值X）/预期值的标准差s，SI越小，表明越靠近靶值，成绩越好。0-1.0为优秀,1.1-2.0为良好,>2.0为差。SI无正负之分。

【质量改进（Quality Improvement，QI）】

质量改进的建议来源于三方面：

1.室内质控：提示实验的精密度差，应规范各项操作；

2.室间质评：提示实验的准确性差，应改进设备的准备或更换试剂；

3.病人或医生的报怨：提示实验的偶然误差，应分析实验的质控过程是否达标。

操作人员 部门主管 质量负责人

姓名 ****** ****** ******

日期 **年**月**日