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概述
●临床免疫化学技术是利用抗原抗体反应原理检测生物体内物质的技术，属临床化学技术范畴。
●该技术的引入使临床化学检验发生了革命性的变化：检测项目不断增加；方法的灵敏度更高、特异性更强；自动化程度更高。
●尤其是为疾病的诊断、疗效观察及病因探讨提供了更直接和客观的资料。
技术分类
●均相--固相 标记--非标记
●时间顺序：
免疫比浊- 固相（单双扩、电泳）比 浊、透射比浊、散射比浊
荧光免疫- 均相、非均相、荧光偏振、酶促荧光放大、荧光标记、时间分辩
技术分类
放射免疫
酶免疫
发光免疫-生物发光、化学发光（直接发光、酶促发光）、电化学发光
传感器
免疫芯片
免疫流式术
免疫比浊测定（Immunoturbidimetry）
●历史
免疫沉淀试验：环状沉淀、絮状沉淀、凝胶
(琼脂）内沉淀（单双扩）
免疫电泳：凝胶、琼脂糖
透射比浊：1959年Schultze发明
免疫胶乳比浊法
散射比浊：1967年Ritchie发明
速率法（1977年）
速率抑制法（1978年）
透射比浊测定法（Transmission tubidimetry）
◎原理：一定波长的光线通过免疫反应样品时被免疫复合物反射、吸收而减弱，在一定范围内，透射光被吸收的量（A值变化）与复合物量呈正相关，而复合物量与抗原和抗体的量呈函数关系。固定某一物量可从标准曲线得知另一物量。
◎仪器：常规化学分析仪
◎项目：Ig类、CRP、类风湿因子、载脂蛋白等
◎缺点：终点法（需一定量的复合物）、复合物颗粒要大（35-100nm，检测范围窄）、灵敏度低（μg级）
散射比浊法（Nephelometry）
◎原理：光线通过检测溶液时，被其中所含的抗原抗体复合物折射而部分偏转，产生散射光，其强度与复合物的数量和散射夹角成正比，与光的波长成反比。遵守Rayleigh方程，即：
I?=I0[（μ2-n02￡?N2U/μ02?4?2]
￡¨1+cos2è￡?
散射比浊法（Nephelometry）
◎使用较短波长的入射光和增加散射夹角，可以提高检测的敏感性。常用的光源有：
①荧光：高压汞灯发射，l=355nm，q=90°，优点是波长短夹角大，缺点是光源功率小，波长范围小；
②激光：氦氖灯发射，l=633nm，q=15-35°，优点是功率大，缺点是波长长，夹角小且单一波长；
③碘钨光：碘钨灯发射，l=400-500nm，q=70°，波长较短，光谱广，夹角大.
荧光免疫分析技术（Fluorescence Immunoassay）
◎常见荧光色素：
◎异硫氰酸荧光黄（FITC）最大吸收光谱490-495nm，最大发射光谱520-530nm，呈明亮的黄绿色荧光；
◎四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）最大吸收光谱550nm，最大发射光谱600-620nm，呈现橙红色荧光，用于双标记示踪技术
◎藻红蛋白（PE）最大吸收光谱490-560nm，最大发射光谱575nm，呈红色荧光，双标记
◎7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），最大吸收光谱354nm，最大发射光谱430nm，呈蓝色荧光，双、多标记
◎镧系元素铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、铽（Tb3+）等，在紫外光（340nm）激发下，发射出高强度荧光（613nm），持续时间较长（10-1000μs），单、双、多标记
荧光免疫分析技术（FIA）
◎常见分析方法
◎均相技术：用二种荧光素分别标记抗原、抗体，通过荧光激发传递使一种荧光被吸收，其吸收量与样品中待测物质成正比，由标准曲线推算出含量。一般用FITC-罗丹明（TRITC、RB200）
◎荧光偏振技术
◎酶促荧光放大技术
◎底物标记荧光技术
◎时间分辨技术
酶促荧光放大免疫分析技术（Fluorescence Enzyme Immunoassay）
◎原理 利用具有潜在荧光的底物作为酶标物催化放大的显示系统，由于累积放大和荧光的高敏感性，使方法学的灵敏度提高很多。
◎FEIA应用的酶及荧光底物
酶 底物 产物 激发光 发射光
a- G MUG MU 360nm 450nm
AP MUP MU 360nm 450nm
HRP HPA 二聚体 317nm 414nm
脱氢酶 NADH NAD 450nm
FEIA的常见仪器
●AXSYM（雅培）
◎原理
FEIA(微粒子双抗夹心法)
+FPIA(竞争法)
◎主要参数 80-120T/hr（15'first）60-90个样品杯，20个试剂仓，二套激发光源
◎项目 激素、肿瘤标记物、心血管标记物、肝炎等病毒标记物、维生素、药物浓度等 FEIA的常见仪器
●VIDAS（梅里埃）
◎原理
固相塑料吸头包被的双抗夹心法
◎主要参数
5个测试仓,每仓6个通道(放试剂条) 20-40min/T,90T/hr,无交叉污染标准曲线稳定(每2周单点校准1次)
◎项目 病毒标记物\细菌及毒素抗原\激素\肿瘤标记物\过敏原\凝血及心脏功能共60多项
FEIA的常见仪器
◎Aura Flex（美国核电公司）
◎原理 磁珠法和标记酶直接催化发光底物发光（AKP标记，4-MUP为底物）
◎仪器参数 72T/hr，15min（first），140样品位，
20试剂位；标准曲线由5个标准品自制，每月一次二点校准
◎项目 激素/肿瘤标记物/病毒标记物/心血管标记物/自身抗体
时间分辨荧光免疫技术
(Time-resolved Fluoroimmunoassay)
◎一般荧光技术的缺点是荧光寿命短、背景荧光高。背景荧光来自散射光（样品池中的胶体颗粒和溶剂分子引起）和非特异荧光（血清中蛋白质及其他化合物）
◎常见荧光团的荧光寿命
荧光团 寿命 荧光团 寿命
非特异荧光 1-10ns 异硫氰酸荧光素 4.5ns
白蛋白 4.1ns 丹磺酰氯 14ns
球蛋白 3.0ns 稀土螯合物 10ìs-1ms
细胞色素C 3.5ns
TR-FIA
◎稀土离子的荧光特点 寿命长(比背景荧光长3-4个量级)
Stokes位移大(铕270nm、铽250nm）
◎稀土离子的标记方法
必须通过一种很强的双功能螯合剂才能和抗原抗体的氨基相连,螯合剂有:1-(对苯偶氮)-EDTA,异硫氰酸苯基-EDTA,
异硫氰酸苯甲基EDTA, 二乙三胺五乙酸(DTPA)
◎反应原理 竞争法\双抗夹心法
◎荧光检测 固相的稀土离子需由增强溶液将其解吸进溶液形成强荧光螯合物才可获得高信嘈比及高灵敏度
增强溶液的组成:a-苯甲酰基三氟丙酮( a-NTA￡?,三正辛基氧化膦（TOPO）￡ TritonX-100 , 乙酸盐, pH2.8-3.5
TR-FIA的仪器
◎Auto DELFIA(EG&G Wallac)全自动TR-FIA仪由Arcus1230荧光仪和DELEFIA试剂盒组合而成
◎原理 96孔PS板式的双抗夹心法，洗板机分离；稀土离子标记
◎主要参数 Auto机由样品处理、实验运行、检测、数据处理四部分组成；一次同时放36架×12管样品，成批测定1152T/hr；标准曲线根据kit的标准品自己制备，每次试验至少二点定标；有双、多标记技术可一次检测三-四种物质
◎项目 激素、肿瘤标记物、病毒标记物、药物、贫血和过敏原等
化学发光免疫技术(Chemiluminescence Immunoassay,CLIA)
◎发光物质
◎生物发光 荧火虫发光是荧光素和荧光素ATP\Mg2+\O2的协同作用下产生,?max562nm;
发光细菌由黄素单核苷酸FMN\氧\直链脂肪醛RCHO参与在细菌荧光素酶催化的复杂过程, ?max475-485nm
◎化学发光 鲁米诺衍生物, ?max425nm
三苯基咪唑(洛酚碱), ?max530nm
二甲基吖啶硝酸盐(光泽精) ?max470nm
三氯苯基草酸盐(TCPO) ?max450nm
CLIA技术分类
◎标记发光物直接参与发光反应
氨丁（己）基乙基异鲁米诺，
吖啶酯类
◎标记酶直接催化发光底物反应
过氧化物酶（催化鲁米诺和过氧化氢体系）
荧光素酶（催化荧光素与腺苷三磷酸体系）
荧光素（催化TCPO发光体系）
CLIA技术分类
◎标记酶催化的产物再作用于发光物质（酶促放大）
葡萄糖氧化酶（葡萄糖为底物，产物过氧化氢作用于鲁米诺及增强剂而发光）
半乳糖苷酶（乳糖为底物，产物作用于TCPO和荧光素体系发光）
G-6-PDH（NAD为底物，产物NADH作用于生物发光体系）
碱性磷酸酶/丙酮酸激酶（ATP为底物，作用于荧光素酶-ATP发光体系）
CLIA的仪器
●ACS:180 SE和ACS:CENTAUR(拜尔)
◎原理 磁性微粒子分离技术和直接化学发光技术，吖啶酯为发光标记物，双抗夹心法和竞争法
◎仪器参数
180SE：180T/hr，15min（first），20s间隔，60个样品，13种试剂
CENTAUR：240T/hr，180个样品，30种试剂
标准曲线预制，7-28d二点校准
◎项目 激数/肿瘤标记物/药物/心血管标记物/贫血
CLIA的仪器
●Vitros Eci（强生）Ortho-Kodak-Amersham
◎原理 酶连（生物素-亲和素系统）免疫技术，增强化学发光技术；HRP为标记物，弹形塑料管为固相载体，鲁米诺为发光剂，专利的增强剂三氯四羟基乙酰苯胺可使发光增强、延时、稳定
◎仪器参数 90T/hr，15-40min（first），60个样品，20种试剂；标准曲线预制每28d1-3点校准
◎项目 激素/肿瘤标记物/病毒标记物/心血管标记物/贫血
CLIA的仪器
●Access（Beckman-Coulter）
◎原理 磁微粒技术和酶放大化学发光技术；碱磷酶标记，顺磁微粒为固相载体，AMPPD为发光底物；AMPD发光稳定时间长，易于检测
◎仪器参数 100T/hr，10-30min（first），60个样品孔，24种试剂仓；标准曲线用5个标准品自制，每28d单点校准
◎项目 激素/肿瘤标记物/病毒标记物/心血管标记物/贫血/药物
CLIA的仪器
●IMUULITE 2000（DPC，得普）
◎原理 塑料珠为载体，碱磷酶标记，AMPPD为发光底物；离心洗涤方式（专利）
◎仪器参数 200T/hr，15-30min（first），90个样品位，24种试剂位；标准曲线预制，每天二点定标，每月校准一次
◎项目激素/肿瘤标记物/病毒标记物/过敏原/贫血/药物
电化学发光免疫分析（Electro-Chemiluminescence Immunoassay，ECLIA）
o 原理 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，包括电化学和化学发光二个过程。
o 发光剂[Ru(bpy)3]2+（三联吡啶钌）和电子供体TPA（三丙胺）在阳电极表面各失去一个电子， [Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，成为强氧化剂；TPA被氧化成阳离子自由基TPA+*。TPA+*不稳定，自发失去一个质子（H+),形成自由基TPA*，一种强还原剂； TPA*给 [Ru(bpy)3]3+一个电子使其变成激发态[Ru(bpy)3]2+*，后者极不稳定，发射一个620nm的光子后回到基态。
这一过程在电极表面周而复始的进行，产生许多光子，使信号加强。
ECLIA原理
●特点
◎灵敏度高,检测下限达1pmol
◎线性范围宽,6个数量级
◎快速,定量分析仅需几分钟
◎应用范围广,无论分子大小均可在相同的灵敏度及线性范围内检测,包括核酸
◎试剂只有二种,2-5℃保存一年,易于自动化
◎批内批间CV为4%和7%
ECLIA的仪器
●ELECSYS 1010&2010(罗氏)
◎原理 顺磁性微粒做载体（生物素-亲和素偶联技术）+电化学发光技术；夹心法和竞争法
◎仪器参数
1010型 60T/hr,9-18min(first),66样品位,6试剂位
2010型 90T/hr,9-18min(first),30-75样品位,18
试剂位;所有标准曲线预制,28d/2点定标校准
◎项目 激素/肿瘤标记物/病毒标记物/心血管标记物/药物
免疫传感器
(Immuno-Transducer)
●免疫传感器由敏感膜\换能器\信号处理三部分组成,技术的关键是敏感膜的构建和能量的转换。
●敏感膜的构建 敏感膜由膜基质和敏感材料组成
◎膜基质 敏感材料的载体，影响膜的寿命、稳定性、背景信号等。一般有金属材料（钯、铂、锑）/无机材料（硅、氧化硅、硫化银、锗）/有机材料（聚苯乙烯、硅橡胶、乙酸纤维素、卵磷脂、海藻酸）
◎敏感材料 一般采用酶、抗体、受体、核酸片段
电化学免疫传感器
●测量免疫反应后引起的电位或电流变化的一类传感器
●传感膜的制备 载体有天然高分子（蛋白质、纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖）；合成高聚物（聚苯乙烯、尼龙、聚苯烯酰胺、氨聚酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物）；敏感材料的固定方法有：
◎吸附法 依靠静电力、范德华引力及氢键力物理吸附
◎包埋法 在载体形成聚合物的同时将敏感材料包裹其中
◎交联法 用双功能试剂（ConA、KIO4、ACM环氧树脂）将敏感材料与载体连接
◎偶联法 用偶联剂（戊二醛、叠氮钠、溴化氰、SMCC）将敏感材料与载体偶联
电化学免疫传感器
●电化学免疫传感器实例
◎hCG传感器 Aizawa的标记电极（HRP、纤维素膜,氧电极），2-100IU；Robinson的标记电极（GOD、磁性玻碳膜，磁电极），7-100IU；
◎AFP传感器 Aizawa（HRP，醋酸纤维膜，氧电极），5-500ng/ml；Kumakura用-78℃?线照射丙烯酸-2-羟基乙酯单体和抗AFP的混合液聚合成膜，氧电极，HRP标记，1-500ng/ml
◎人血清蛋白免疫传感器
◎IgG免疫传感器
◎胰岛素免疫传感器
光学免疫传感器
●测量免疫反应后引起的光学信号变化量的一类传感器。光学信号包括光吸收、荧光、磷光、反/折/散射等，所以具有较大的发展空间
免疫传感器
(Immuno-Transducer)
量值溯源
◎校准(CALIBRETE)：在规定条件下，为确定测量仪器（或测量系统）所指定的量值，或实物量具（或参考物质）所代表的值，与对应的有测量标准所复现的值之间关系的一组操作。自主行为。质控措施如空白、标记物的监控不是校准。
◎检定：查明和确定计量器具是否符合法定要求的程序，包括检查、加标记和出具证书。强制性。由计量机构执行。
◎测试系统：一种分析方法的组合体，包括使用的方法学、试剂、校准品(Calibretor)、配件、设备
◎何时需校准或检定：使用前、周期性、修理后、
系统改变
溯源图
测量系统（仪器、试剂）
测定值 Calibrate
校准
测量标准
参考标准 国际标准 有证参考物（CRM)
或国家标准 参考物
工作标准 校准品
传递标准 定值质控品
室间质评（实验室间比对计划）
过程控制
◎医学实验室的过程控制即室内质控
◎所有检测项目均需有室内质控措施
◎项目操作者就是该项目的质控负责人
◎要有文件说明质控的程序
◎用质控物进行监控须符合省推荐RCV的要求（见各专业质量管理方案）
◎无质控措施不得出具报告
"批"-RUN的概念
◎CLIA'88，§493.1218(b)定义:
测试系统的准确性、精密度保持稳定的一个间隔,不超过24小时。
●临床化学、临床血液学的每天点图应为每批点图，有失控点后重测的数据为另一批的质控点
●临床免疫学的批为一块板或一批条件不变的标本，以此为质控点点图
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