胶乳免疫比浊法试剂测光点选择问题

一直有个疑惑，胶乳免疫的比浊法的试剂，为什么大部分厂家测光点1都是在加入R2之后？
抗原抗体的反应速度很快，加入R2之后，很快就会发生反应。测光点1放在加入R2之后，实际上浪费了反应速度最快，灵敏度最高的一段时间。

搜索相关帖子，有一个回答：
https://www.yeec.com/forum.php?mod=viewthread&tid=10278
“R2试剂本底吸光度很高，读在R2加入之前无法消除本底空白（如h－CRP）”
但是仍然有疑问，R2虽然本底吸光度高，但本身是均一的液体，吸光度是一致的，不变的。
减去R1+样本吸光度后，应该是可以消除掉样本带来的吸光度差异。
而和酶促反应不同，抗原抗体反应速度很快，读点在R2加入后，实际上浪费了反应速度最快，灵敏度最高的一段时间。

这个问题你要是问试剂厂家，回答都是国外厂家就是如此，难以令人信服。但有一点可以肯定，所谓的减去什么反应空白的说法纯属无稽之谈。
玩生化快20年了，个人分析有以下几点可能：
1 免疫比浊项目移植到生化分析仪上时间并不长，不过10几年的时间，盲从是一方面。理由如下：免疫专用仪器或血凝仪器的免疫比浊通道是最早进行免疫比浊项目的设备，但这些设备都有一个特点，就是无法从第一试剂加入时就开始读数（无论是吸光度还是光子数），只能在所有试剂加入后反应开始启动时，放入读数器进行连续持久的读数，中间没有任何间隔。为了获取反应度，这类设备一般的读数方式设计成开始读取一点，最后反应终点再读取一点，二者的吸光度或光子数差就是反应度。当然，化学发光是减去空白光子数。初始反应读数作为反应监测使用。
这类反应曲线近似如下：


图1
由于设备设计的原因，无法读取PX也就是启动反应试剂之前的曲线。那么这些项目在移植到生化仪上后，就进行了盲从，也采用R2之后两点的读点方式。
2 反应曲线是非典型终点法曲线，采用固定点法读点方式，两个读点也在R2之后，这个也属于盲从。这类反应曲线近似如下：


图2
A、B两点就是PX启动反应试剂加入后的两点。但可以看出，读取A、B两点，不如读取C、B两点来的准确。
3 R2加入之后，出现与正常反应方向相反的应激曲线，为了获得准确的反应度，将读点设置在应激最大值和反应终点。这类反应曲线近似如下：


图3
这类曲线在国外厂家和国内某些厂家的免疫比浊项目都有，出现这类曲线，将读点设置在R2之后是最佳选择，更为准确。
有些国内厂家疑惑，我们的配方就是国外厂家的，怎么人家的有这样的曲线，我们的做出来就是标准的终点法曲线，没有这个应激。这个含蓄的回答是试剂能力问题，露骨的说法是你稀释了多少倍？人家是多少倍？举一个简单的例子，国外厂家的某项目速率法试剂能做到1000浓度不出现底物耗尽现象，而你的300浓度就会出现底物耗尽现象。这也就是人家卖5千，你卖2千的原因所在。正常标本都正常，异常标本都异常，反正要稀释复查的，这就是国内厂家的思维逻辑。
4 还有的项目在早先的仪器上启动反应后，确实有延迟现象，在R2之后能看到一个完整的终点法曲线，有基线、反应区和终点区。所以，这类读点要在R2之后，一般常见在凝血类设备上。这个基线区可能会延长到几十秒，用于生化上足够了。但是，没有见过任何一家的免疫比浊项目的生化反应曲线出现基线区，所以，还是盲从。
这就是常见的四类原因。
其实，在生化上移植免疫比浊项目有局限性，因为生化的读点有时间间隔，并非连续监测，所以在后读点设置上很难。下图举例说明：


图4
上图的红绿黑三条曲线分别表示浓度高中低，P1是R2之后的第一个读点，P2是反应的终点，后读点如此设置在生化上已经是很完美了。但问题也是很明显，就是P1和P2之间的反应度，并不是随着浓度的增高而增加，而是相反或变得不确定，这样就会出现严重的偏离，结果也就不准确。同样，由于第一读点在反应斜坡上，重复性很难保证。
同样，如果读点选择为P3和P2之间，那么结果就变得准确，反应度随着浓度的升高而增加。可惜，生化仪无法设置半个读点或十分之一个读点。这也就是日立类机型（读点的计算方式是读点选取点和其前一点的均值）此类项目后读点比AU系列机型（读点计算方式就是读点选取点本身）要好一些的原因。
这就是生化仪的特点导致后读点无法完美设置的原因，生化仪的读点一般都是10几秒，这10几秒的时间反应速度快的项目几乎可以接近反应终点了。
所以，如果不是3的情况，还是老老实实的在R2之前之后各一点比较稳妥，重复性好，结果准确。
当然，R2之前之后各一点，会受到血清指数的影响而导致假性偏低甚至负值，但这不是主要问题，可以通过反应监测或LIH监测进行报警，或样品空白进行消除。

看了郑工的回答，又学了很多东西。非常感谢！

谢谢分享

真是高人，领教了

郑振寰 发表于 2018-7-24 20:38
这个问题你要是问试剂厂家，回答都是国外厂家就是如此，难以令人信服。但有一点可以肯定，所谓的减去什么反 ...

感谢郑老师的回复，非常详尽！

但有一点还有疑问
“R2之前之后各一点，会受到血清指数的影响而导致假性偏低甚至负值”
脂血黄疸之类，造成的浊度，应该是和抗原抗体的浊度叠加的吧？
也就是减去P1吸光度的时候，不是已经把血清本身的浊度扣除了吗？为什么还会有影响呢？
另外，根据郑老师的回复，P1设置在加入R2之前，其实更科学吧？

血清指数会造成R1+S的吸光度过高，甚至会高于R2之后的终点吸光度，二者相减就变成了负值。有个概念要清楚，读点在R1+S上，并不是扣除什么空白，而是记录一个基线，意味着反应从这里开始。从这个基线到反应终点之间的差值就是反应度，当然受正负反应的影响算法不同。真正的扣除样品空白的方法是样品自身空白，用水当试剂先对样品进行比色，再按照 常规参数用试剂测试，二者相减才是扣除了样品空白。

中升的试剂应用给的在AU5800上的设置参数，很多免疫比浊的方法的第一读点都是从加入R2后的12点开始的，现在看来，也不能完全相信了！                                       
                                       
TEST        CYSC        CYSC(胶乳）        mMALB        LPA胶乳        MB
SAMPLE  VOL             3        2        12        2        5
R1  VOL        130        160        150        160        150
R2  VOL        130        40        15        40        50
WAVELENGTH-1        600        570        340        700        570
WAVELENGTH-2                700                        800
METHOD        END        END        END        END        END
REACTION SLOPE         +        +        +        +        +
FIRST POINT-1        12        13        10        12        12
LAST  POINT-2        27        27        27        27        27
NO LAG-TIME        -        -        -        -        -
REAGENT OD L             0        0        0        0        0
Reagent OD Limit Last: H        2.5        2.5        2.5        2.5        2.5
M IN-OD        0        0        0        0        0
MAX-OD        2.5        2.5        2.5        2.5        2.5
LINEARITY   %        -        -        -        -        -
UNIT        mg/L        mg/L        mg/L        mg/L        mg/ml
FACTOR        -        -        -        -        -
STANDARD        *        *        *        *        *
Calibration Type                                       
Formula                                       

谢谢分享资料

看了郑工的回答，又学了很多东西。非常感谢！

学习了，谢谢！

代表性的问题，详尽的分析解答，先收藏学习，实践中领悟

郑振寰 发表于 2018-7-24 20:38
这个问题你要是问试剂厂家，回答都是国外厂家就是如此，难以令人信服。但有一点可以肯定，所谓的减去什么反 ...

最近和一些厂家同行讨论这个问题，他们的解释是胶乳试剂R2本身的吸光度很高，加样量略有波动就会对测试结果有明显的影响

实际上根本不存在厂家的说法，这种说法仅存在于免疫和凝血专用仪器，对于生化来说，每个读点都10几秒，足够延时了。

谢谢分享

学习学习再学习！

学习了

学习了

个人感觉读点如何设置是为了测试项目的重复性（精密度）来进行服务的，有些试剂均匀性完全可控，批间差小，也可以选择在加入R2前，如果试剂均匀性略差，机器读点稍微不稳，则会牺牲部分灵敏度，保证重复性（第一个读点在12或13）

学习了，感谢经验分享