[转发]临床免疫分析的质量控制

临床免疫分析技术是检验医学中最活跃的成分之一, 尤其以化学发光免疫测定和速率散射免疫浊度测定为代表定量免疫分析在临床诊断中的地位日益显著, 同时其质量问题也倍受关注。Westgard 博士曾经指出，质量控制并非不假思索便可成就，也没有独一无二的“做质控” 方法，以为2SD界限就是标准质控的观念看来既过时又浪费。可见临床检验的质量控制（QC）的理论和实践也是与时俱进地的、不断发展着的。
一、临床检验QC模式的演进
1.Levey-Jennings图和单一规则的应用
2.Westgard 多规则QC
3.个性化设计的QC
(1)注重成本效益的QC,较低的假失控概率(小于5% ), 较高的误差检出率(大于90%), 测定尽可能少的质控物, 尽可能简单的规则。
(2)根据要求、实际条件和需要选择质控规则和测定的质控物数目:
重新评价性能Þ确定质控方法（包括质控规则及质控品测定个数）Þ评价误差检出概率（Ped）和假误差概率（Pfr）Þ画出OPSpecs图Þ评价本实验室分析项目的不精确度（CV%）和不准确度（Bris）Þ设定质量目标（确定分析项目的TEr）
二、临床免疫分析的QC
1.临床免疫分析的特点:自动分析仪具有较高的精度和稳定性, 标准曲线和校准特点, 试剂配套, 试剂的生物特性
2.发光免疫分析的类型、原理和特点:分为以下3类
(1)化学发光免疫分析: 标记物水平的化学发光…
例如，吖啶酯（acridinium ester）的发光反应（非酶促反应）：
吖啶酯（标记物） + 过氧化氢 ------>光
(2) 酶放大的化学发光免疫分析: 底物水平的化学发光…
例如，碱性磷酸酶催化的发光反应：
二氧丁环（dioxetane）磷酸盐 ---------〉光
(3) 荧光免疫分析:光激发的发光,包括底物水平的荧光和镧系元素螯合物(时间分辨荧光免疫分析，
前者如碱性磷酸酶催化的荧光：
伞型酮磷酸盐（无荧光） 伞型酮（有荧光）
后者属于与化学发光并肩发展的一种同样有前途的标记免疫技术，铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)和镝(Dy)四种元素能发射离子荧光,其螯合物可用作荧光标记。铕、钐的荧光特点是峰移大：Eu 3+ 或Sm 3+ 经激发后， 其激发光与发射光的波峰之间有一个很大的峰移(stoke shift)（大约290nm）， s），m发射光谱（615nm或643nm）和激发光谱（337nm），它们不会相互重叠。发射峰很陡峭，便于双标记。荧光半衰期长：正常非特异性背景荧光的生命期是0•01微秒（ s。激发后延时测量，可排除背景荧光的干扰。但是，镧系元素络合物在水中的荧光很弱，ms， 钐螯合物为41m铕螯合物的发射荧光衰变期超过430 需加入增强溶液使之解离出来， 再形成新的络合物进行测定，故又称分解－增强－镧系荧光免疫分析
3. 特定蛋白分析的原理和特点: 速率散射免疫浊度分析是非标记免疫分析中特异性和灵敏度最高一种方法,近年来由于采用新技术使灵敏度有大为提高。其关键是用聚乙二醇加速并增强免疫沉淀反应，以散射浊度的动态变化曲线获得反应过程中的最大变化速率（峰值速率），利用抗原（或抗体）浓度与峰值速率的函数关系测的结果。透射免疫分析或终点法分析的结果远远不如速率散射免疫浊度分析，主要表现在不够灵敏、基质的干扰大、测定范围小。
4. 临床免疫分析QC的特点:
（1） QC的成本高：质控物和封闭式试剂价格高，
（2） 错误的QC结果（包括假失控）会造城较大损失
（3） 生物试剂的特性多：抗体的滴度及亲和力，固相包被状况、标记状况，以及校准物状况都可影响到靶值和标准曲线完善性,
（4） 不同方法（甚至试剂）的差异有时非常大
5. 临床免疫分析QC的必要性和紧迫性:
临床免疫分析的许多项目已成为临床诊断的重要依据。不良结果会损害患者的利益，同时也给实验室带来不好的形象，许多情况下还会激化医患矛盾。以PRL为例，情况令人十分担忧.
2002年第二次内分泌室间质量评价总结中催乳素(PRL):
(除外3s)各种方法的结果
方法 (N) CV% ( 均值/中位数/ 最大/最小),
所有方法(86): 43.42% ( 5.29/ 4.86 / 1577/ 21 )
放射免疫(15): 67.89% ( 973 / 748 / 2415 / 79 )
化学发光(47): 18.57% ( 467 / 467 / 744 / 336 )
微粒酶免(13): 32.65% ( 544 / 553 / 721 / 27 )
酶联免疫(2): ***% ( *** / *** / 486 / 261 )
电化发光(5): 26.38% ( 631 / 686 / 796 / 379 )
时间分辨(2): ***% ( *** / *** / 666 / 367 )
三、 临床免疫分析QC的实施
设定质量目标，评价本室所用方法的不精密度（CV%）和不准确度（平均偏差），利用QC Easy软件画出OPSpecs图，确定操作点，评价失控概率，选择QC规则和每次测定质控个数，采取全面质量控制策略，重新评价性能
(一) 室内质控的实际操作
1、确认质控物的靶值
在开始室内质控时，首先要设定质控品的靶值。各实验室在已确定各个测定项目的反应线性和校准良好的情况下，应对新批号的质控品的各个测定项目重行确认靶值（用现行的测定方法），一般应在说明书标定的范围以内。
（1） 暂定靶值的设定: 新批号的质控品应与当前使用的质控品一起进行测定。根据20或更多独立批获得的至少20次质控测定结果，计算出均值，作为暂定靶值。以此暂定靶值作为下一个月室内质控图的靶值进行室内质控；一个月结束后，将该月的在控结果与前20个质控测定结果汇集在一起，计算累积均值（第一个月），以此累积的平均数做为下一个月质控图的靶值。重复上述操作过程，连续三至五个月。
（2）常用靶值的设立: 以最初20个数据和三至五个月在控数据汇集的所有数据计算的累积均值作为质控品有效期内的常用靶值。
2、设定控制限
对新批号质控品应确定控制限，控制限通常以标准差（s）的倍数表示。在刚开始时可暂由总许误差（TEa）计算，即各项目用1/4TEa 作为质控图的标准差(以13.5s为失控规则)。临床实验室不同项目（定量测定）的控制限的设定要根据其采用的控制规则来决定。
3、质控规则的选择
多年来我们常选用12s作为警告规则、13s规则作为失控规则，再辅以Westgard多规则中的其他常用规则。近来，卫生部临床检验中心建议有条件的实验室应采用OPSpecs图法或功效函数图法来选择质控方法。
4、绘制质控图及记录质控结果
根据质控品的靶值和控制限绘制Levey-Jennings控制图（每张图一个浓度水平），将选择的质控规则应用于质控数据，判断每一分析批是在控还是失控。
（二）失控情况处理及原因分析
1、失控情况处理
操作者在测定质控时，如发现质控数据违背了控制规则，应填写失控报告单，尤其上一级做出是否发出与测定质控品相关的那批患者检验报告的决定。
2、失控原因分析
失控信号的出现受多种因素的影响，这些因素包括操作上的失误、试剂、校准物、质控品的失效，仪器维护不良以及采用的质控规则、控制限范围、一次测定的质控标本数等等。失控信号一旦出现就意味着与测定质控品相关的那批病人标本报告可能作废。此时，首先要尽量查明导致的原因，然后再随机挑选出一定比例（例如5%或10%）的患者标本进行重新测定，最后根据既定标准判断先前测定结果是否可接受，对失控做出恰当的判断。对判断为真失控的情况，应该在重做质控结果在控以后，对相应的所有失控患者标本进行重新测定。如失控信号被判断为假失控时，常规测定报告可以按原先测定结果发出，不必重做。当得到失控信号时，可以采用如下步骤去寻找原因：
（1） 利用“多规则”判断失控类型：是随机误差还是系统误差造成的？例如出现13s 或 R4s 是随机误差，而出现22s、 41s 或10x 则是系统误差。批内的随机误差多数是仪器的问题，只有批间的随机误差、没有批内的随机误差则多数是试剂的问题。系统误差可由新配质控物的问题（稀释错误），校准物的问题（降解、稀释错误、校准时的随机误差、定值不准等），如果只有个别项目失控涉及试剂的可能性较大（换批号后未重新校准，试剂变化等），如果几乎所有项目都失控基本可肯定是仪器问题。环境变化造成的影响往往是渐进的、一般不太明显。
（2） 先排除假失控报警，看一下质控的异常是否伴随大多数标本的异常，是单个项目失控？还是多数项目失控？是何种类型的失控？能否排除质控物本身的问题？必要时可以使用多个不同来源的商品化定值质控物。
（3） 确定重测：直接重测同一质控物、或新开一瓶质控物重测失控项目？还是校准后重测质控物？是否要更换试剂？等等，须根据判断来决定。
（4） 如果认为仪器的精度不好则应进行仪器维护（检查仪器状态，查明光源是否需要更换，比色杯是否需要清洗或更换？对仪器进行清洗等维护），校准各测定项目后重测质控物。
（5） 如果怀疑试剂问题，更换试剂以查明原因。试剂的质量也反映在校准曲线完善性上。
（6） 请专家帮助。如果前五步都未能得到在控结果，那可能是仪器或试剂的原因，需要和仪器或试剂厂家联系。
（三）室内质控数据的管理
1．每月室内质控数据统计处理
2．每月室内质控数据的保存
3．每月上报的质控数据图表
4．室内质控数据的周期性评价
（四）美国CLIA’88能力比对检验的分析质量要求（部分临床免疫分析项目）
分析物或试验 可接受范围
皮质醇 靶值±25%
游离甲状腺素（FT4） 靶值±3s
人绒毛膜促性腺激素(HCG) 靶值±3s
三碘甲状腺素原氨酸（T3） 靶值±3s
甲状腺素（T4） 靶值±20%，12.9%(10ug/L)
　　地高辛(digoxin) 靶值±20%或0.2ug/L
　　庆大霉素 靶值±25%
　　苯巴比妥(phenobarbit 靶值±20%
　　苯妥英(phenytoin) 靶值±25%
　　茶碱(theophylline) 靶值±25%
妥布霉素(tobramycin) 靶值±25%
　　丙戊酸（Valproic acid） 靶值±25%
1-抗胰蛋白酶 靶值±3sa　　
　　补体3 靶值±3s
　　补体4 靶值±3s
　　甲胎蛋白 靶值±3s
　　IgA 靶值±3s
　　IgE 靶值±3s
　　IgG 靶值±25%
　 IgM 靶值±3s
四、临床检验QC中热点问题的回答
1、有了先进的仪器和配套的试剂、校准品和质控物, 临床实验室还需要自己关注质量问题吗?
答：经过以上讨论，您一定不会赞成这种观点。先进的仪器和配套的试剂、校准品和质控物为实现优秀实验室创造了基本条件。但是，保证临床免疫分析结果的稳定可靠，仍然需要实验室本身的不懈努力；实现各实验室间结果的可比性，则需要实验室之间的共同努力。仪器生产商的质量体系不能代替实验室自己的质量体系。我们对于检验结果的质量负有全部责任。
2、多规则QC的好处是什么？那些规则检出系统误差敏感？那些规则检出随机误差敏感？那些原因分别造成这些误差？
答：使用12s规则的假失控概率太高（往往大于5%）, 而13s规则的误差检出率太低（小于1%），许多有医学意义的误差未能检出。采用多规则能降低假失控概率，维持较高的误差检出率。此外，多规则有助于分析误差的性质，为判断失控的原因提供信息。多规则还能提示潜在的误差倾向，便于及时纠正。13s 或 R4s 对随机误差敏感，而22s、 41s 或10x 则是系统误差的标志。目前的临床免疫分析中随机误差可因试剂混合不匀、含有气泡或颗粒，仪器的加样针和注射泵精度下降，光路问题，标本处理不妥等造成。而系统误差则由定值不准的标准品、校准时带入较大误差、空白不当、试剂准备不当、试剂降解、检测器漂移、仪器部件性能下降、温育设定不当等等引起的。
3、在哪些情况下可以采用单一规则？
答：当单一规则的QC步骤能够满足90%的失控检出率，并能保证小于5%的假失控概率，就可先用该单一规则进行质控，一般可从12.5S、13S或13.5S中选择。
4、进行多规则QC一定要使用2个以上的质控物吗？
答：要看是在那一国，美国的法规USA CLIA QC requirements 要求指控物的数目不少于2个。但这对于我们却是毫无约束力的。我们可以根据自己的情况和需要确定质控物的数目。每次可以只用1个指控物。也可定期测定2~3个不同水平的质控物以了解标准曲线的完善性。
5、 每次QC可以容许间隔多长时间？
答：这需要看您仪器的稳定性和失控概率大小而定，当然，每天质控最好。
6、 市售质控物标定的s（SD）是否太大？ 怎么办？
答：自己重新测定并计算，要求在市售质控物说明书标定的范围内。
7、41s和10x是失控/拒绝的规则还是警告的规则？
答：当12S出现后41s和10x是失控/拒绝的规则，否则就是警告规则。表明可能存在系统误差。
8、定标后立即测定临床标本，可以不做QC吗？
答：恰恰是定标后或仪器校准后一定要做QC。因为定标会带入系统误差。
9、国际单位（IU）就是国际单位制（SI）单位吗？我们为什么必须采用以SI单位为主体的计量单位？
答：IU不是SI单位，凡是试剂说明书标明换算因子的，应尽可能转变为（n、u或m）g的形式，g/L属于法定单位，我国政府已颁布计量法，我们必须采用以SI单位为主体的法定计量单位。